Bookshelf

Processing of Clinical Specimens

Pobierając próbki od pacjentów w celu izolacji i identyfikacji bakterii beztlenowych związanych z zakażeniami, należy podjąć środki ostrożności w celu wykluczenia powietrza (Ryc. 17-3). Materiały do hodowli beztlenowców najlepiej pobierać za pomocą igły i strzykawki. Jeśli próbka nie może być natychmiast wysłana do laboratorium, jest ona umieszczana w beztlenowej probówce transportowej zawierającej dwutlenek węgla lub azot pozbawiony tlenu. Próbka jest wstrzykiwana przez gumowy korek w probówce transportowej i pozostaje w środowisku beztlenowym probówki do czasu jej przetworzenia w laboratorium bakteriologicznym. Jeśli próbka jest pobierana za pomocą wymazówki, używany jest tylko specjalny, dostępny w handlu system transportu wymazówek beztlenowych.

Próbki powinny być wolne od bakterii zanieczyszczających. Materiał z miejsc, które są normalnie sterylne, takie jak krew, płyn rdzeniowy lub płyn opłucnowy, nie stanowi problemu, pod warunkiem, że podjęte są zwykłe środki ostrożności w celu właściwego odkażenia skóry przed jej nakłuciem w celu uzyskania próbki. Próbki kału, plwociny lub wydzieliny z pochwy nie mogą być rutynowo hodowane w kierunku patogennych beztlenowców, ponieważ zazwyczaj zawierają inne organizmy beztlenowe. W takich przypadkach należy pobierać aspiraty z ropni lub miejsc zakażenia, aby uniknąć nadmiernego zanieczyszczenia składnikami flory lokalnej.

Pomimo, że dostępnych jest kilka technik utrzymywania beztlenowego środowiska podczas przetwarzania próbek na posiewy beztlenowe, najbardziej powszechny jest słoik do hodowli beztlenowców. Jest to średniej wielkości szklany lub plastikowy słoik ze szczelnie przylegającą pokrywką zawierającą cząsteczki tlenku glinu powlekane palladem, które służą jako katalizator. Można go ustawić na dwa sposoby. Najprostsza z nich wykorzystuje dostępną w handlu kopertę generatora wodoru i dwutlenku węgla (GasPak), którą umieszcza się w słoiku wraz z płytkami hodowlanymi. Generator jest aktywowany wodą. Tlen znajdujący się w słoiku i wytworzony wodór są przekształcane w wodę w obecności katalizatora, co powoduje powstanie warunków beztlenowych. Dwutlenek węgla, który jest również wytwarzany, jest wymagany do wzrostu przez niektóre beztlenowce i stymuluje wzrost innych. Alternatywna metoda osiągnięcia beztlenowości w słoiku polega na ewakuacji i wymianie powietrza. Powietrze jest usuwane z zamkniętego słoika zawierającego płytki hodowlane i zastępowane beztlenową mieszaniną 80 procent azotu, 10 procent wodoru i 10 procent dwutlenku węgla.

Do izolowania mikroorganizmów wyjątkowo wrażliwych na tlen, które nie mogą być odzyskane przy użyciu słoika beztlenowego, stosuje się bardziej wyrafinowane procedury. Jedna z nich, metoda probówki walcowej, składa się z zamkniętej probówki zawierającej gaz beztlenowy i cienką warstwę wstępnie przygotowanego podłoża agarowego na jej wewnętrznej powierzchni. Podłoże w probówce jest inokulowane za pomocą pętli, podczas gdy probówka jest obracana. Powoduje to powstanie spiralnego śladu na powierzchni agaru. Probówka jest przepłukiwana strumieniem dwutlenku węgla, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza, gdy jest otwarta podczas inokulacji.

Inną innowacją opracowaną do izolacji bakterii beztlenowych jest beztlenowy izolator rękawicowy. Jest to w zasadzie duża komora z przezroczystego winylu, z dołączonymi rękawicami, zawierająca mieszaninę 80 procent azotu, 10 procent wodoru i 10 procent dwutlenku węgla. Śluza na jednym końcu komory wyposażona jest w dwa włazy, jeden prowadzący na zewnątrz, a drugi do wnętrza komory. Próbki są umieszczane w śluzie, zewnętrzny właz jest zamykany, a powietrze w śluzie jest ewakuowane i zastępowane mieszaniną gazów. Wewnętrzny właz jest następnie otwierany w celu wprowadzenia próbki do komory. Konwencjonalne procedury bakteriologiczne są stosowane do obróbki próbki w atmosferze beztlenowej.

Mimo, że te złożone systemy są potrzebne do izolacji składników flory beztlenowej, badania wykazały, że słoik beztlenowy jest odpowiedni do odzyskiwania istotnych klinicznie beztlenowców. Wyjątkowo wrażliwe na tlen bakterie tej mikroflory najwyraźniej nie są związane z procesami zakaźnymi.

Procedury hodowli i identyfikacji bakterii beztlenowych są dobrze znane (Ryc. 17-3). Do hodowli beztlenowców dostępne są różne podłoża selektywne i nieselektywne. Niezawodne, nieselektywne podłoże składa się z agaru Brucella uzupełnionego krwią owczą, heminą, cysteiną, węglanem sodu i menadionem. Do identyfikacji beztlenowców stosuje się zwykłe procedury bakteriologiczne. Opierają się one na reakcji barwienia metodą Grama, morfologii komórek i kolonii, wzorcach wrażliwości na antybiotyki, reakcjach fermentacji węglowodanów i innych testach biochemicznych. Analiza końcowych produktów przemiany materii, zwłaszcza kwasów organicznych, dostarcza dodatkowych informacji przydatnych w klasyfikacji tych organizmów.