4 Rodzaje danych pozyskiwanych w badaniach UPLC-MS
Platformy UPLC-MS pozyskują trzy różne rodzaje danych poprzez akwizycję online w rutynowych zastosowaniach (1) chromatograficzny czas retencji; (2) widma masowe z dokładnością do pełnego skanu m/z; oraz (3) widma MS/MS. Dane o ruchliwości jonów mogą być również pozyskiwane online. Te cztery typy danych mogą być zastosowane do identyfikacji struktur chemicznych metabolitów, których tożsamość nie była znana przed pozyskaniem danych lub do potwierdzenia tożsamości metabolitów, których tożsamość była znana przed pozyskaniem danych. Zbieranie danych MSn, gdzie n > 2 nie jest rutynowo pozyskiwane online, a zamiast tego stosuje się zbieranie frakcji i infuzję frakcji przez minuty, na przykład przy użyciu systemu Triversa Nanomate, który umożliwia długie okresy infuzji przy użyciu małych objętości próbek (< 10 μL) .
System UPLC i spektrometr mas generują uzupełniające się informacje. Chromatograficzny czas retencji jest określony przez „rozpuszczalność” metabolitu w fazie stacjonarnej i ruchomej i zapewnia rozdzielenie metabolitów w podejściu komplementarnym do tych stosowanych w spektrometrze mas. Przewidywanie in silico czasów retencji, na przykład w oparciu o wartości log P dla zastosowań fazy odwróconej i HILIC, jest obecnie rozwijane w społeczności badawczej. Wymagane są dalsze badania i rozwój w celu poprawy przewidywania czasów retencji in silico oraz wprowadzenia wskaźników retencji, aby umożliwić porównanie danych w różnych instrumentach i kolumnach .
Podczas przebiegu chromatograficznego widmo masowe pełnego skanu jest zbierane raz lub więcej razy w każdej sekundzie. To widmo masowe określa m/z wszystkich jonów obecnych w danym momencie. Dla faz stacjonarnych HILIC stosowanych do analizy wszystkich typów próbek i faz stacjonarnych C18 do analizy moczu, rutynowo stosuje się zakres m/z od 50 (lub 100) do 1000. Do badań lipidomicznych stosuje się zakres m/z od 200-1500 lub 2000, wyższa górna granica pozwala na wykrycie triacylogliceroli i kardiolipin o wyższej masie cząsteczkowej. Każdy pełny skan tworzy widmo masowe z danymi m/z i intensywności, które mogą być wykorzystane do wykreślenia chromatogramów pojedynczych jonów lub chromatogramów pików podstawowych z wysoką dokładnością mas dla każdego wykrytego metabolitu. Chromatogramy pojedynczych jonów wykreślają pojedyncze m/z ze zdefiniowanym przez użytkownika zakresem mas dla każdego punktu danych uzyskanych na chromatogramie, podczas gdy chromatogramy pików bazowych wykreślają najwyższe natężenie m/z dla każdego punktu danych, wykreślone m/z może być takie samo lub różne dane m/z mogą być wykreślone dla różnych punktów danych. Chromatogramy pojedynczych jonów są wykreślane w celu określenia powierzchni pików, które są stosowane w analizie danych w oprogramowaniu do przetwarzania danych. Złożoność widma masowego jonizacji elektrospray, w którym wykrywane są cechy wielu metabolitów reprezentujących ten sam metabolit, zostanie omówiona w rozdziale 8.
Fragmentacja metabolitów w fazie gazowej jest stosowana do generowania widma masowego MS/MS, które jest reprezentatywne dla struktury chemicznej metabolitu, ponieważ różne struktury chemiczne będą generować różne widma MS/MS. Widmo MS/MS jest zależne od struktury chemicznej i może być zastosowane (najlepiej w połączeniu z separacją chromatograficzną) do identyfikacji różnych izomerów, które mają takie samo m/z. Dwa różne typy danych MS/MS mogą być uzyskane, analiza zależna od danych (DDA) i analiza niezależna od danych (DIA/SWATH) . DDA jest tradycyjnie stosowanym podejściem, w którym uzyskuje się widmo masowe przed skanowaniem, z którego wybiera się pewną liczbę pików m/z do wyodrębnienia (zwykle w kwadrupolu) analizatora mas, po czym następuje fragmentacja w komórce kolizyjnej i późniejsza analiza masowa w celu uzyskania widma masowego jonu produktu MS/MS. Wybór pojedynczego lub wielu pików m/z, które mają być izolowane i fragmentowane w serii, jest zwykle oparty na intensywności, przy czym m/z o najwyższej intensywności jest izolowany i fragmentowany jako pierwszy. Jest to określone w podejściu górnym „n”, gdzie n jest liczbą różnych pików m/z poddanych fragmentacji między każdą akwizycją pełnego skanowania. Szereg reguł można zastosować obliczeniowo w celu zapewnienia, że (1) powtarzające się zbieranie tego samego okna izolacji m/z nie jest obserwowane poprzez powtarzające się zliczanie; (2) piki szumu chemicznego nie są fragmentowane poprzez zastosowanie wstępnie zdefiniowanej listy wykluczeń; (3) metabolity są fragmentowane poprzez zastosowanie listy włączenia. Szerokość izolacji jest określana przez analityka i wynosi zazwyczaj ± 1 lub 2 Da, a zatem pojedynczy lub wielokrotny metabolit może zostać wyizolowany i pofragmentowany, a następnie wygenerowane złożone widmo masowe MS/MS. Szerokość izolacji wynosząca > 1.0 Da pozwala na włączenie pików izotopowych 13C (13C, stabilny izotop, jest obecny w około 1.1% w naturalnej obfitości) do procesu fragmentacji i obserwację informacji izotopowej 13C w widmie masowym MS/MS. Czystość okna izolacyjnego nie jest zwykle uwzględniana przy dopasowywaniu eksperymentalnych widm MS/MS do widm MS/MS dostępnych w bibliotekach widm masowych i uzyskanych w wyniku analizy czystych, autentycznych wzorców chemicznych. Oprogramowanie do obliczania czystości widm masowych MS/MS (msPurity) zostało niedawno opracowane i wykazało, że średnia czystość 70% lub większa jest rutynowo obserwowana w badaniach fenotypu metabolicznego nieukierunkowanego. Chociaż DDA jest najbardziej rutynowo stosowaną metodą, ma ona ograniczenia (1) widma masowe MS/MS dla wszystkich metabolitów nie są uzyskiwane w analizach o długości 15 minut; (2) różne typy jonów (np. jony protonowane i sodowane addukty) tego samego metabolitu mogą być wybrane do fragmentacji, mimo że wymagany jest tylko jeden typ jonu; (3) typ fragmentowanego jonu nie jest inteligentnie zdefiniowany, chociaż różne typy jonów mogą fragmentować łatwiej i bardziej informacyjnie (np, jon protonowany byłby bardziej odpowiedni i bogaty w informacje niż sodowany jon adduktowy, który ulega fragmentacji w wyniku utraty jonu sodowego, przy czym nie obserwuje się żadnej innej znaczącej fragmentacji). Energia zderzenia zastosowana do uzyskania informatywnego widma MS/MS zależy również od struktury chemicznej, żadna pojedyncza energia zderzenia nie jest odpowiednia dla wszystkich metabolitów i zamiast tego należy zastosować szeroki zakres energii zderzenia. Różne podejścia mogą być zastosowane w celu maksymalizacji informatywnego widma MS/MS. W pierwszym podejściu stosuje się wiele energii zderzenia do fragmentacji tego samego metabolitu, a następnie łączy się wiele widm MS/MS w jedno złożone widmo masowe MS/MS, i jest to określane jako stopniowane energie zderzenia . Drugie podejście stosuje tę samą energię zderzenia dla pojedynczego wstrzyknięcia próbki, ale stosuje inną energię zderzenia dla różnych wstrzyknięć próbki . Pozwala to na uzyskanie widm MS/MS specyficznych dla energii zderzenia. Jednakże, głównym ograniczeniem pozyskiwania danych DDA jest to, że widmo masowe MS/MS nie jest pozyskiwane dla wszystkich metabolitów w badaniach nieukierunkowanych .
Aby przezwyciężyć zmniejszone pokrycie metabolitów danymi MS/MS pozyskanymi przy zastosowaniu DDA, można zastosować alternatywne podejście zwane analizą niezależną od danych; jest to również określane jako SWATH . Jak sama nazwa wskazuje, akwizycja danych MS/MS jest niezależna od danych i wszelkich reguł stosowanych w DDA. Zamiast tego, stosowane są szersze okna izolacyjne (np. 25 Da) i widmo masowe MS/MS jest pozyskiwane dla wszystkich jonów obecnych w każdym oknie izolacyjnym w serii w całym zakresie m/z. Takie podejście zapewnia, że widmo masowe MS/MS jest pozyskiwane dla wszystkich metabolitów, chociaż widmo masowe MS/MS może być złożeniem wielu metabolitów lub jonów szumu chemicznego i dlatego konstruowane jest widmo MS/MS o niższej czystości. Rozdzielczość pików chromatograficznych, które nie są współdziałające, może być zastosowana do obliczeniowego wyprowadzenia widma masowego MS/MS dla każdego oddzielnego metabolitu. Widmo masowe może być wykorzystane do anotacji metabolitów lub do kwantyfikacji, ponieważ dane MS/MS są zbierane w sposób ciągły dla wszystkich metabolitów. Aby umożliwić akwizycję danych DIA, wymagane są spektrometry masowe z szybkimi prędkościami skanowania lub UPLC z szerszymi pikami chromatograficznymi, aby zapewnić, że odpowiednia liczba punktów danych pełnego skanowania jest zbierana w całym piku chromatograficznym w połączeniu z maksymalnie 40 oknami DIA, które również są pozyskiwane. Metody DIA powstały w wyniku opracowania przez Aebersolda technologii SWATH, która została następnie skomercjalizowana przez firmę Sciex, najpierw do zastosowań proteomicznych, a ostatnio do zastosowań metabolomicznych. Inne platformy instrumentalne również oferują możliwości DIA. W proteomice, biblioteka DIA składająca się z widm masowych MS/MS dla wszystkich możliwych białek/peptydów jest zwykle stosowana w celu wspomagania i zwiększenia dokładności etapu dekonwolucji poprzez wyszukiwanie każdego widma masowego. Można to zrobić, gdy znany jest kompletny proteom i wykonano konstrukcję in silico bibliotek MS/MS. Jednakże, w przypadku fenotypowania metabolicznego, wszystkie metabolity, których obecność jest spodziewana, nie są obecnie znane, brak autentycznych wzorców chemicznych jest ograniczający, a podejścia in silico do dokładnego przewidywania widm masowych MS/MS są obecnie ograniczone. Dlatego też podejście to można zastosować do podzbioru znanych metabolitów z biblioteką MS/MS lub można zastosować nieukierunkowane podejście DIA z dekonwolucją wykonywaną zależnie lub niezależnie od biblioteki MS/MS (np. stosując MS-DIAL ).
Niektóre metody stosują zakres m/z dla okna izolacji identyczny z zakresem m/z pełnego skanowania, co prowadzi do fragmentacji wszystkich jonów w tym dużym oknie izolacji i wytworzenia złożonego widma masowego MS/MS wymagającego obliczeniowej dekonwolucji. Platformy Waters mogą stosować MSE, gdzie niska i wysoka energia kolizji są stosowane na przemian w celu zebrania danych pełnego skanu i danych MS/MS dla wszystkich jonów w każdym punkcie czasowym, a platformy Thermo Scientific mogą stosować fragmentację wszystkich jonów (AIF). Rozdzielczość chromatograficzna metabolitów i szybkość skanowania mogą mieć znaczący wpływ na dokładność etapu dekonwolucji i czystość widm mas MS/MS pojedynczych metabolitów.