Czy istnieją naturalnie występujące bakterie pleomorficzne we krwi zdrowych ludzi?

W naszych poszukiwaniach spirochetów zaangażowanych w chorobę Alzheimera (13), zaobserwowaliśmy pleomorficzne bakterie we krwi zdrowych ludzi za pomocą mikroskopii ciemnego pola. Było to zaskakujące odkrycie, ponieważ powszechnie uznaje się, że krwioobieg u zdrowych ludzi jest środowiskiem sterylnym (7), z wyjątkiem sytuacji, w których dochodzi do naruszenia integralności błon tkankowych (6). Jednakże, koncepcja występowania bakterii we krwi zdrowych ludzi jest obecnie bardziej prawdopodobna dzięki zastosowaniu metod laboratoryjnych niezależnych od hodowli. Główne techniki stosowane w takich badaniach obejmują amplifikację PCR i sekwencjonowanie rybosomalnego DNA16S (rDNA). Metody te ujawniły obecność szerokiej różnorodności mikroorganizmów w środowisku, a także w organizmie człowieka (12). W niniejszym raporcie przedstawiamy dowody oparte na technikach filogenetyki molekularnej oraz mikroskopii świetlnej i elektronowej, jak również innych konwencjonalnych metodach mikrobiologicznych, na istnienie populacji bakterii w zdrowej krwi ludzkiej. Wobec pozornie kontrowersyjnego charakteru naszych ustaleń, zachęcające jest ostatnie doniesienie Nikkari i wsp. (14), którzy wykryli związane z krwią bakteryjne sekwencje rDNA, stosując metody real-time PCR i sondę celującą w konserwatywne regiony bakteryjnego 16S rDNA, oraz wcześniejsze doniesienie Tedeshi i wsp. (16) o obecności pleomorficznych bakterii jako pasożytów wewnątrzerytrocytarnych u klinicznie zdrowych ludzi.

Do badania pod mikroskopem świetlnym, próbki krwi od 25 zdrowych ochotników zostały pobrane do probówki Vacutainer bez antykoagulantów (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.); krew została pobrana w konwencjonalny sposób obejmujący antyseptykę skóry i unikanie jakiegokolwiek wprowadzenia zewnętrznych mikroorganizmów przez zanieczyszczenie. (Ponieważ skażenie zewnętrzne zawsze było możliwe, przez cały czas zachowywano szczególną ostrożność i środki ostrożności, aby tego uniknąć. Szczegółowe procedury, jak również odpowiednie kontrole, są wyszczególnione w całym tekście). Mokry preparat surowicy ze skrzepniętej krwi każdej próbki, świeżej lub inkubowanej w temperaturze 30°C przez 5 do 7 dni, został zbadany pod mikroskopem w ciemnym polu (Leitz Dialux 20) w poszukiwaniu bakterii pleomorficznych.

Do amplifikacji PCR, 0,5-ml porcja inkubowanej krwi zawierająca bakterie pleomorficzne została użyta do konwencjonalnej ekstrakcji DNA metodą Higuchi (11). Trzy mikrolitry ekstraktu wykorzystano do amplifikacji DNA metodą Edwardsa et al. (8) przy użyciu startera BSF8/20 (5′-AGTTGATCCTGCTCAG-3′) i startera odwrotnego BSR1541/20 (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′).Przeprowadzono trzydzieści cykli PCR, przy czym 1 cykl składał się z następujących etapów: (i) denaturacja (1 min w 94°C), (ii) wyżarzanie (30 s w 70°C), oraz (iii) przedłużenie (90 s w 72°C). Polimeraza DNA Vent (New England BioLabs, Mississauga, Ontario, Kanada) została użyta ze względu na jej zdolność do korekty.

Amplikony zostały rozdzielone przez standardową elektroforezę w żelu i wykryte przez barwienie bromkiem etydyny. DNA oczyszczano przy użyciu zestawu Geneclean II (Bio 101, Inc., La Jolla, Calif.), a następnie klonowano do miejsca SmaI wektora pBluescript II (Stratagene, La Jolla, Calif.). Analizę sekwencji nukleotydów dwóch losowo wybranych klonów przeprowadzono przy użyciu automatycznego sekwenatora DNA ABI (model 373A) oraz zestawów do sekwencjonowania cyklicznego ABI Prism z polimerazą AmpliTaq FS (Perkin-Elmer Corp., Boston, Mass.).

Gen gyrB amplifikowano metodą PCR według protokołu przedstawionego przez Yamamoto i Harayamę (21). Amplikony zostały sklonowane przy użyciu zestawu do klonowania TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).

Dane dotyczące sekwencji zostały przeanalizowane przy użyciu programu BLASTN z National Center for Biotechnology Information (Bethesda, Md.) (1). Sekwencje kandydujące o najwyższej punktacji zostały odpowiednio wyselekcjonowane i wyrównane przy użyciu programu NALIGN firmy PC/Gene (Intelligenetics, Inc.).

Aby wykonać hybrydyzację fluorescencyjną in situ (FISH), krew została pobrana w typowych, identycznych warunkach aseptycznych (w celu uniknięcia kontaminacji) od trzech zdrowych osób i inkubowana przez 6 dni w temperaturze 30°C w sterylnych szklanych probówkach wewnętrznych (16 na 100 mm) marki Vacutainer. Próbkę krwi rozcieńczano w stosunku 1:10 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionym 10 mM pirofosforanem. Próbkę odwirowywano przez 5 s, a następnie filtrowano przez sterylny filtr strzykawkowy Acrodisc o wielkości porów 0,8 μm w celu usunięcia czerwonych krwinek i zanieczyszczeń. Jednomililitrowe podwielokrotności próbki wirowano przez 10 min przy 14 000 × g. Kolejne procedury utrwalania i hybrydyzacji przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym przez Thomasa i wsp. (17). W skrócie, osuszone komórki bakteryjne utrwalano za pomocą 1 ml 3% (wt/vol) świeżo przygotowanego paraformaldehydu w 4°C przez 24 h. Następnie komórki były granulowane przez 10 min przy 14 000 × g i permeabilizowane przez inkubację osadu z 1 ml zimnej mieszaniny etanolu i PBS (1:1, vol/vol) przez 5 min w 25°C. Bakterie przemywano PBS i ponownie zawieszano w 50 μl buforu hybrydyzacyjnego (0,9 M NaCl, 20 mM Tris ), który ogrzewano do 50°C i uzupełniano 10 ng sond fluorescencyjnych na μl. Wszystkie użyte sondy były oligonukleotydami znakowanymi fluoresceiną, ukierunkowanymi na rRNA: sonda eubakteryjna (EUB) BSR1541/20 (8); non-EUB, która jest komplementarna do uniwersalnej sondy bakteryjnej EUB, używanej jako kontrola negatywna niespecyficzności (3); oraz sonda eukariotyczna EUK (18). Zawiesiny inkubowano przez 24 h w temperaturze 50°C, a hybrydyzację przerywano przez odwirowanie próbek przez 2 min przy 8000 × g, wyrzucenie supernatantu i dodanie 1 ml PBS. Bromek etydyny (0,5 μg/ml) dodawano tuż przed analizą cytometrii przepływowej.

Do mikroskopii elektronowej komórki bakteryjne w inkubowanych próbkach krwi od osób zdrowych oddzielano od elementów krwi następującą metodą. Krew rozcieńczoną w PBS w stosunku 1:10 odwirowano w mikrowirówce przy 14 000 × g przez 5 s. Supernatant usunięto i odwirowywano jak opisano powyżej przez 10 min. Zdekantowano go, a osad przepłukano dwukrotnie w PBS. Osad zawierający wysokie stężenie bakterii z krwi został ponownie zawieszony w końcowej małej objętości PBS. Alternatywnie, krew rozcieńczoną w stosunku 1:10 w PBS filtrowano przez filtr membranowy o wielkości porów 0,45 μm. Przesącz odwirowano przy 14,000 × g przez 10 minut, a osad przepłukano dwukrotnie PBS. Ten osad był również ponownie zawieszany w małej objętości PBS do mikroskopii elektronowej. Negatywne barwienie wykonano przy użyciu 2% kwasu fosfotungstowego. W celu przygotowania do ultracienkich przekrojów, komórki utrwalano w 2,5% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze kakodylowym przez 2 h. Następnie komórki odwadniano, osadzano i sekcjonowano. Wycinki barwiono octanem uranylu i cytrynianem ołowiu, a następnie badano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) JEOL 2000 FX.

Zmotywowani obserwacją tego, co wydawało się być niezwykłym mikrobem w próbce krwi od zdrowej osoby, zbadaliśmy kilka próbek krwi na obecność bakterii metodą amplifikacji PCR 16S rDNA przy użyciu uniwersalnych starterów. Nie wykryto żadnego produktu z krwi z dnia 0 (przez barwienie bromkiem etydyny), ale produkt PCR był wykrywalny po inkubacji krwi w temperaturze 30°C przez 5 dni. Inokulacja podwielokrotności próbek krwi z dnia 0 lub dnia 5 do bulionu odżywczego nie spowodowała wzrostu bakterii. Najwyraźniej uzyskany sygnał PCR nie był wynikiem kontaminacji bakteriami saprofitycznymi.

Zamplifikowane metodą PCR fragmenty DNA o rozmiarach 1,2 i 1,5 kb pochodzące od tych bakterii zostały sklonowane. Dwa zrekombinowane plazmidy, B16 i T5, wykorzystano do sekwencjonowania DNA. Obie sekwencje były identyczne z wyjątkiem obciętego końca 5′ w B16. Prawie kompletny gen 16S rRNA T5 (1,257 bp) wykazywał 99,6% identyczności z sekwencją 1,500-bp Stenotrophomonas maltophilia LMG958T, szczepu typu z Laboratorium voor Microbiologie Gent Culture Collection, Ghent, Belgia. Sekwencja T5 oznaczona na obu niciach wykazała cztery przejścia i dwie transwersje w porównaniu z sekwencją LM958T (numer akcesyjny GenBank X95923). To odkrycie zostało potwierdzone w drugiej próbce pochodzącej od innego uczestnika. (Pozycja filogenetyczna S. maltophilia jest przedmiotem intensywnych badań. Pierwotnie nazwany Pseudomonas maltophilia, został później nazwany Xanthomonas maltophilia. S. maltophilia jest zgrupowana w podklasie gamma Proteobacteria i stanowi odrębny takson.)

Niezależna amplifikacja 16S rDNA z próbek krwi od trzech dodatkowych osób została uzyskana przez jednego z nas (M. Sirois) na Uniwersytecie Quebec w Trois-Rivieres w Kanadzie. Analiza sekwencji genu rybosomalnego 16S z próbek krwi od tych trzech osób wykazała, że rodzajem bakterii o najbliższej homologii był Pseudomonas. Potwierdza to nasze ustalenia z Uniwersytetu McGill, ponieważ Stenotrophomonas, jak wskazano powyżej, była wcześniej częścią rodzaju Pseudomonas.

W uzupełnieniu do wyników 16S rRNA uzyskanych na Uniwersytecie McGill, amplifikowaliśmy również PCR genu gyrB bakterii z próbek krwi. Gen gyrB koduje podjednostkę B białka gyrazy DNA. Amplifikacja PCR genu gyrB jest nową metodą molekularną służącą do wykrywania i identyfikacji szczepów bakteryjnych (21). Sekwencja 475-bp fragmentu PCR, który uzyskaliśmy w naszym laboratorium, okazała się różna od sekwencji częściowego genu gyrB (1,252 bp) szczepu S. maltophilia typu ATCC 13637. Tak więc izolat, który wyizolowaliśmy z krwi nie jest identyczny z S. maltophilia ATCC 13637, lecz jest innym szczepem.

FISH bakterii z krwi był również wykonywany (2, 4). Stwierdziliśmy, że konwencjonalne metody whole-cell FISH z użyciem znakowanej fluoresceiną sondy oligonukleotydowej BSR1541/20 (komplementarnej do regionu na 3′ końcu 16S rRNA konserwowanego dla wszystkich eubakterii) były nieodpowiednie z powodu lizy delikatnych bakterii. Aby obejść ten problem, zawiesina bakterii we krwi była badana protokołem FISH i laserową cytometrią przepływową (LFC) (3, 17). Technika ta ma potencjał szybkiej analizy zdolnych do życia, ale niehodowalnych bakterii.

Rysunek 1A pokazuje profil rozpraszania światła zawiesiny bakteryjnej zarejestrowany przez LFC, który odzwierciedla komórki i możliwe szczątki oraz szum tła. Wyznaczyliśmy region (region a) tego profilu, w którym rejestrowane były zdarzenia fluorescencyjne. Sygnały fluorescencyjne emitowane z komórek, które hybrydyzowały z sondą niespecyficzną (non-EUB) znakowaną fluoresceiną (średnia intensywność fluorescencji 3,9) są pokazane na Rys. 1B. MFI zarejestrowane w regionie e na próbkach krwi pobranych od trzech różnych osób w 2 różnych dniach były 2,5- do 3,7-krotnie wyższe z sondą BSR1541/20 niż te uzyskane z sondą nie-EUB (Tabela 1). Sygnały fluorescencyjne z sondy EUK znakowanej fluoresceiną (17), specyficznej dla regionu 18S rRNA konserwowanego u wszystkich eukariotów, nie różniły się od sygnałów sondy nie-EUB.

W celu dalszej charakterystyki tej grupy bakterii przeprowadzono badania morfologiczne. Próbki surowicy z próbek krwi, które zostały pobrane aseptycznie od 25 ochotników, a następnie pozwolono im skrzepnąć, ujawniły obecność bakterii badanych za pomocą mikroskopii ciemnego pola. Na rysunku 2 przedstawiono morfologię grupy komórek przygotowanych z próbki surowicy.

Oprócz ich ruchu komórkowego, takiego jak zginanie, żywotność tych pleomorficznych bakterii została wzmocniona ich zdolnością do zwiększania skromnej liczby w surowicy po tlenowej inkubacji próbki zakrzepłej krwi w temperaturze 30°C przez 7 dni. Tabela 2 przedstawia wzrost liczby komórek w siedmiu próbkach krwi. Organizmy te nie były saprofitycznymi zanieczyszczeniami bakteryjnymi, ponieważ nie zaobserwowano wzrostu bakterii, gdy porcje surowicy zostały posiane na wzbogacone podłoże agarowe. Niestety, próby wyhodowania bakterii na różnych wzbogaconych podłożach laboratoryjnych, takich jak pożywka dla krwi, agar dla spirochetów, agar dla mykoplazm i pożywka dla leptospirali, nie powiodły się. Stwierdzono, że bakterie pleomorficzne we krwi były żywotne, ale nie mogły być hodowane in vitro przy użyciu konwencjonalnych technik. Należy zauważyć, że popłuczyny z probówek do pobierania krwi nie dawały bakterii pleomorficznych podczas badania pod mikroskopem w ciemnym polu, co wskazuje, że probówki nie były źródłem tych bakterii.

Bakterie wyizolowane z próbek krwi były selektywnie hamowane przez antybiotyki. W tabeli 3 przedstawiono wpływ dwóch antybiotyków na wzrost bakterii w surowicach. Polimyksyna B była najbardziej inhibitorowa, podczas gdy bacytracyna miała ograniczone działanie.

Mikrograf cienkiego wycinka bakterii wyizolowanych z próbek krwi przedstawiono na ryc. 3. Komórki były otoczone podwójną błoną bez śladów gęstej warstwy peptydoglikanu; nie znaleziono dyskretnych jąder ani organelli wewnątrzkomórkowych związanych z błoną, typowych dla eukariotów. Jest oczywiste, że bakterie pleomorficzne pochodzące z krwi są raczej jednostkami wysoce zorganizowanymi niż przypadkowymi szczątkami białkowymi powstałymi w wyniku degradacji elementów komórkowych krwi.

Dzięki zastosowaniu technik PCR i FISH, byliśmy w stanie wykazać, że krew od klinicznie zdrowych ludzi zawiera bakteryjne DNA. PCR genu 16S rRNA jest szeroko stosowany do identyfikacji bakterii nie nadających się do uprawy w środowisku (5, 9); taka identyfikacja została również przeprowadzona w przypadku nieznanych bakterii w obrębie ludzkiego gospodarza (12), a ostatnio we krwi od klinicznie zdrowych osób (14). FISH była z powodzeniem stosowana do wykrywania specyficznych, nienaruszonych, pojedynczych mikroorganizmów w próbkach środowiskowych, takich jak woda z jeziora (18), gleba (17) i osad czynny (20), a także niehodowlanych bakterii beztlenowych we florze kałowej człowieka (19).

Nasze doniesienie o naturalnie występujących żywotnych bakteriach pleomorficznych we krwi zdrowego człowieka nie powinno budzić kontrowersji. G. Tedeshi i wsp. z Uniwersytetu w Camerino we Włoszech zgłosili obecność podobnych bakterii jako pasożytów wewnątrzerytrocytarnych u klinicznie zdrowych ludzi w 1969 r. w czasopiśmie Nature (16). Wykazali oni, że czerwone krwinki zwiększyły absorpcję lub inkorporację radioaktywnej tyminy, urydyny i glicyny z powodu obecności tych bakterii. Inkorporacja tych związków nie jest częścią normalnej aktywności metabolicznej erytrocytów. Ostatnie odkrycie bakteryjnego 16S rDNA we krwi zdrowych ludzi przez Nikkari i wsp. (14) dodaje wiarygodności naszym odkryciom. Wykorzystując współczesne techniki biologii molekularnej, wykazaliśmy obecność dyskretnych bakterii w surowicy zdrowych ludzi, które wykazują morfologiczne podobieństwo do tych udokumentowanych przez Tedeshi i wsp. Nasze odkrycia są takie, że istnieją bakterie pleomorficzne we krwi zdrowych ludzi.

• Copyright © 2002 American Society for Microbiology