Klinische Bedeutung eines Alloantikörpers gegen das Kell-Blutgruppen-Glykoprotein

Tabelle 1

Eine periphere Blutprobe des Probanden wurde an unser Referenzlabor geschickt, weil ein IgG-RBC-Aloantikörper vorhanden war, der mit allen Panel-RBCs in der anti-humanen Globulinphase in niedrig-ionischer Lösung und mit Papain-modifizierten Erythrozyten reagierte (3+). Das mütterliche Serum war nicht reaktiv, wenn es entweder mit Dithiothreitol-behandelten oder mit EDTA/Glycinsäure-behandelten RBCs getestet wurde. Der Titer des Antikörpers gegen die ABO-kompatiblen Erythrozyten ihres Mannes betrug 128. Eine erweiterte Erythrozyten-Typisierung wurde mit der Röhrchentechnik durchgeführt und der folgende Phänotyp wurde identifiziert: C+ c+ E- e+; M+ N- S- s+; Fy(a+ b+); Jk(a+ b-); Lu(a- b+); Le(a- b+); K- k-; Kp(a- b-); Js(a- b-). Die Erythrozyten des Patienten waren negativ für alle untersuchten Kell-Blutgruppen-Antigene typisiert. DAT und Autokontrolle waren sowohl mit der konventionellen Röhrchenmethode als auch mit dem Geltest negativ. Insgesamt deuteten diese Ergebnisse auf einen möglichen K₀-Phänotyp mit dem Vorhandensein eines Anti-Ku-Aloantikörpers hin. Gelegentlich ist es schwierig, durch Serologie zwischen einem K₀- und einem Kmod-Phänotyp zu unterscheiden. Der Nachweis von Kell-Antigenen hängt stark von der Avidität der verwendeten Reagenzien ab; daher ist es manchmal schwierig, die Grenzen zwischen einer schwach positiven und einer negativen Agglutination zu ziehen. In Anbetracht dessen kann die Möglichkeit eines Kmod-Phänotyps mit einem Anti-Ku-ähnlichen Antikörper nicht außer Acht gelassen werden, bis molekulare Untersuchungen durchgeführt werden.

Die KEL-Genotypisierung wurde in der mütterlichen genomischen DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus-Strategien durchgeführt und zeigte KEL*02/02, KEL*04/04 und KEL*07/07 Genotypen. Aufgrund der Diskrepanz zwischen serologischem und molekularem Befund wurde jedes der 19 Exons des KEL-Gens sowie die Intron-Exon-Grenzen mit der Sanger-Didesoxy-Methode sequenziert. Chromatogramme zeigten eine homozygote Substitution eines Guanins zu einem Adenin am ersten Nukleotid von Intron 3 (IVS3 + 1g>a), wodurch die konservierte gt-Sequenz an der 5ʹ-Spleißstelle zu at verändert wird. Dieses Ereignis verursacht ein aberrantes RNA-Spleißen, das das Leseraster verändert und ein vorzeitiges Stoppcodon einführt, das die Expression des Kell-Glykoproteins auf der RBC-Membran verhindert. Sequenzierungsdaten, die vom Exome Aggregation Consortium zur Verfügung gestellt wurden und von 60.706 nicht verwandten Personen unterschiedlicher ethnischer Zugehörigkeit stammen, zeigten, dass die IVS3 + 1g>a-Mutation (dbSNP-Zugang: rs369569464) eine Häufigkeit von 8,29 × 10-5 hat und in europäischen (nicht-finnischen), europäischen (finnischen), lateinamerikanischen und südasiatischen Populationen gefunden wurde. Die IVS3 + 1a-Variante, von der International Society of Blood Transfusion als KEL*02N.06-Allel bezeichnet, ist eine der häufigsten genetischen Grundlagen für den extrem seltenen K₀-Phänotyp. Die molekulare Analyse bestätigte, dass der Proband den K₀-Phänotyp hatte, und es ist sehr wahrscheinlich, dass es sich bei der Spezifität des im Serum des Patienten gefundenen Alloantikörpers tatsächlich um einen Anti-Ku handelte.

Die Familienmitglieder des Probanden wurden mit serologischen und molekularen Methoden untersucht, um sie hinsichtlich einer Alloimmunisierung nach Transfusion und/oder Schwangerschaft angemessen zu beraten. Eine PCR mit sequenzspezifischer Primerstrategie (SSP) wurde entwickelt, um die bei dem Probanden gefundene Mutation nachzuweisen. Es wurden zwei separate PCRs mit einem Vorwärtsprimer (ATCTTTCACCTCTTGGTTCCTCCC) durchgeführt, der komplementär zu einer Konsensussequenz des KEL-Gens ist, gepaart mit Rückwärtsprimern, die an ihren 3ʹ Enden (Position IVS3 + 1) die polymorphen Nukleotide C (GGGGGTCTGGGATCTTGCTTAC) zur Anlagerung an G im KEL-Wildtyp-Allel oder T (GGGGGTCTGGGATCTTGCTTAT) zur Anlagerung an A im KEL*02N enthalten.06 Allel zu verbinden, in jeder Reaktion. Um optimale PCR-Bedingungen zu etablieren, wurden DNA-Proben des Patienten (Genotyp KEL*02N.06/KEL*02N.06) und einer normalen Person (Genotyp KEL*01/KEL*02) verwendet. Amplifikationen wurden mit ca. 0,5 μg genomischer DNA in einem Endvolumen von 10 μl durchgeführt, das 0,4 μmol/l jedes Primers (mit Ausnahme der Primer, die für interne Positivkontrollen verwendet wurden, die bei 0,04 μmol/l lagen), 0,2 mmol/l jedes dNTP, 2 mmol/l MgCl2 und 1 U Taq-DNA-Polymerase in geeignetem Puffer enthielt. Die PCRs begannen mit einem Zyklus der Denaturierung bei 94 °C für 5 min und wurden mit einem Zyklus von 10 min bei 72 °C zur vollständigen Verlängerung beendet. Die Zyklusparameter waren 30 Zyklen von 40 s bei 94 °C, 40 s bei 67 °C zum Annealing und 40 s bei 72 °C zur Extension. In allen PCR-Reaktionen wurde ein Primerpaar, das eine Konsensussequenz des humanen Wachstumshormon-Gens amplifiziert, als interne Positivkontrolle verwendet. Die PCR-Produkte (435 bp für die interne Positivkontrolle und 192 bp für die spezifischen Produkte) wurden durch Elektrophorese auf 2%igen Agarosegelen analysiert. Diese Strategie ermöglicht den Nachweis des KEL*02N.06-Allels in doppelter oder einfacher Dosis. Die serologischen und PCR-SSP-Ergebnisse (Abb. 1) zeigten, dass sieben Familienmitglieder (Mutter, Vater, 2 Schwestern, 1 Bruder und 2 Söhne) k-, Kpb- und Jsb-Antigene exprimieren und eine Einzeldosis des KEL*02N.06-Allels tragen.

Diskussion

Molekulare Studien, die in der Probe des Probanden durchgeführt wurden, ermöglichten die Identifizierung des Allels, das für einen K₀-Phänotyp (KEL*02N.06) in Homozygotie und unterstützen die Schlussfolgerung, dass die Spezifität des bei der Mutter gefundenen Alloantikörpers Anti-Ku war.

Antikörper gegen Antigene im Kell-Blutgruppensystem sind in der Regel IgG und können an hämolytischen Transfusionsreaktionen und HDFN beteiligt sein. Einige Spezifitäten, wie Anti-K und Anti-Kpa, wurden nicht nur mit der IgG-vermittelten Zerstörung reifer Erythrozyten in Verbindung gebracht, sondern auch mit der Unterdrückung der Erythropoese durch Förderung der immunologischen Zerstörung erythroider früher Vorläuferzellen durch Makrophagen in der fetalen Leber . Was Anti-Ku betrifft, so ist über seine klinische Bedeutung wenig bekannt, da sensibilisierte K₀-Individuen selten sind. Während einige Autoren beschrieben, dass Anti-Ku hämolytische Transfusionsreaktionen und HDFN hervorruft, wurde das Fehlen von Hämolyse, die dieser Spezifität zugeschrieben wird, von anderen beobachtet . In unserem Fall waren die Laborbefunde und der klinische Verlauf des Neugeborenen konsistent mit einer immunvermittelten RBC-Zerstörung. Die beim Neugeborenen festgestellte Hyperbilirubinämie nahm progressiv zu und erreichte am dritten Lebenstag ihren Höhepunkt, während gleichzeitig die Hämatokrit- und Hämoglobinwerte abnahmen, was auf eine moderate Anämie hindeutete. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass Mutter und Kind ABO-identisch waren, kann der Anstieg der Bilirubinwerte nicht auf ABO-Inkompatibilität zurückgeführt werden, sondern auf die Wirkung des Anti-Ku-Aloantikörpers, die wiederum von der beteiligten IgG-Subklasse abhängt. Es ist bekannt, dass IgG1 und IgG3 effizient mit den meisten Fcγ-Rezeptoren auf phagozytischen Zellen interagieren, während IgG2 und IgG4 eine reduzierte Affinität zu den meisten dieser Rezeptoren aufweisen. Folglich hängt die Rate der Clearance von sensibilisierten Erythrozyten aus dem Kreislauf von der IgG-Subklasse des an die RBC-Membran gebundenen Antikörpers ab. Leider konnte die IgG-Subklasse nicht bestimmt werden, jedoch deuten die klinischen und Laborbefunde darauf hin, dass in unserem Fall die Hyperbilirubinämie und Anämie des Neugeborenen durch die Immundestruktion der Erythrozyten aufgrund von IgG1 und/oder IgG3 Anti-Ku-Aloantikörpern verursacht wurde. Anzumerken ist, dass Hämatokrit und Hämoglobinspiegel bei der Geburt normal waren und die Retikulozytenzahl an Tag 3 die Produktion von Erythrozyten als Reaktion auf die Anämie widerspiegelte. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das mütterliche Anti-Ku keinen suppressiven Effekt der fetalen Erythropoese während der Schwangerschaft verursacht, wie es für andere Spezifitäten innerhalb des Kell-Blutgruppensystems beschrieben wurde. Andernfalls wären Parameter, die mit der Erythropoese assoziiert sind, beim Neugeborenen deutlich vermindert gewesen.

Das Baby wurde kurzzeitig mit Phototherapie behandelt und am fünften Tag in gutem Zustand nach Hause entlassen. Die Anämie des Babys bildete sich nach 4 Monaten zurück, ohne dass eine Bluttransfusion erforderlich war, und das Hämoglobin blieb im Normalbereich. Im Alter von 1 Jahr war die neurologische Untersuchung des Babys normal und zeigte keine durch die Hyperbilirubinämie verursachten Schäden.

Wir untersuchten außerdem die Familienmitglieder des Probanden, um ihnen eine angemessene Beratung bezüglich der Transfusion und möglicher Alloimmunisierungsereignisse zu geben. Obwohl sie ABO-kompatibel mit dem Probanden waren, wurden keine homozygoten KEL*02N.06-Individuen mit fehlender Kell-Antigen-Expression gefunden. Diese Befunde zeigen, dass Haushaltsmitglieder keine kompatiblen Spender hinsichtlich des Kell-Systems sind. Daher sollten im Bedarfsfall Autotransfusionsprogramme beim Patienten durchgeführt werden. Andernfalls muss ein Hochrisiko-Transfusionsprotokoll befolgt werden, das nur für Extremsituationen angezeigt ist. Aufgrund der serologischen und molekularen Befunde konnten wir die untersuchten Familienmitglieder der Patientin, vor allem ihre beiden Schwestern, darüber informieren, dass für sie kein Risiko besteht, einen Anti-Ku zu entwickeln.

Zusammenfassend liefert unser Fall wertvolle Informationen über serologische, molekulare und klinische Befunde zu HDFN, die mit einem Anti-Ku-Aloantikörper assoziiert sind, der von einer K₀-Schwangeren produziert wurde. Obwohl der Antikörper gegen das Kell-Blutgruppensystem gerichtet war, wurde das Neugeborene erfolgreich mit Phototherapie behandelt, und es war keine Austauschtransfusion erforderlich. Integrierte Phänotyp- und Genotyp-Studien erlaubten präzise medizinische Empfehlungen für die Probandin und ihre Familiengruppe.

Ethische Zustimmung

Die schriftliche, informierte Zustimmung der Patienten wurde eingeholt.

Anerkennung

Wir danken Cecilia Siniscalchi für ihre Unterstützung bei der Laboranalyse.

Disclosure Statement

Die Autoren erklären, dass sie keine für das eingereichte Manuskript relevanten Interessenkonflikte haben.

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