4 Arten von Daten, die in UPLC-MS-Studien erfasst werden
UPLC-MS-Plattformen erfassen drei verschiedene Arten von Daten durch Online-Erfassung in Routineanwendungen (1) chromatographische Retentionszeit; (2) Full-Scan-genaue m/z-Massenspektren; und (3) MS/MS-Spektren. Ionenmobilitätsdaten können ebenfalls online erfasst werden. Diese vier Datentypen können verwendet werden, um die chemischen Strukturen von Metaboliten zu identifizieren, deren Identität vor der Datenerfassung nicht bekannt war, oder um die Identität von Metaboliten zu bestätigen, deren Identität vor der Datenerfassung bekannt war. Die Erfassung von MSn-Daten, bei denen n > 2 ist, wird nicht routinemäßig online erfasst und stattdessen werden Fraktionssammlung und Fraktionsinfusion für Minuten angewandt, z. B. unter Verwendung eines Triversa Nanomate-Systems, das lange Infusionszeiten bei geringen Probenvolumina (< 10 μL) ermöglicht.
Das UPLC-System und das Massenspektrometer erzeugen komplementäre Informationen. Die chromatographische Retentionszeit wird durch die „Löslichkeit“ des Metaboliten in der stationären und mobilen Phase definiert und ermöglicht die Trennung von Metaboliten in einem komplementären Ansatz zu denen im Massenspektrometer. Die in silico-Vorhersage von Retentionszeiten, z. B. basierend auf log P-Werten für Reversed-Phase- und HILIC-Anwendungen, wird in der Forschungsgemeinschaft entwickelt. Weitere Forschungen und Entwicklungen sind erforderlich, um die In-silico-Retentionszeitvorhersage zu verbessern und Retentionsindizes einzuführen, die den Vergleich von Daten über verschiedene Instrumente und Säulen hinweg ermöglichen.
Während eines Chromatographielaufs wird ein Full-Scan-Massenspektrum einmal oder mehrmals pro Sekunde erfasst. Dieses Massenspektrum definiert die m/z aller zu diesem Zeitpunkt vorhandenen Ionen. Bei HILIC-Stationärphasen für die Analyse aller Probentypen und C18-Stationärphasen für die Analyse von Urin wird routinemäßig ein m/z-Bereich von 50 (oder 100) bis 1000 verwendet. Für lipidomische Untersuchungen wird ein m/z-Bereich von 200-1500 oder 2000 verwendet, wobei die höhere Obergrenze die Detektion von Triacylglyceriden und Cardiolipinen mit höherem Molekulargewicht ermöglicht. Jeder vollständige Scan erzeugt ein Massenspektrum mit m/z- und Intensitätsdaten, die zur Erstellung von Einzelionenchromatogrammen oder Basispeak-Chromatogrammen mit hoher Massengenauigkeit für jeden detektierten Metaboliten verwendet werden können. Einzelionenchromatogramme zeichnen eine einzelne m/z mit einem benutzerdefinierten Massenbereich für jeden über ein Chromatogramm erfassten Datenpunkt auf, während Basispeakchromatogramme die höchste Intensität m/z für jeden Datenpunkt aufzeichnen, wobei die aufgezeichnete m/z die gleiche sein kann oder unterschiedliche m/z-Daten für verschiedene Datenpunkte aufgezeichnet werden können. Einzelionenchromatogramme werden geplottet, um Peakflächen zu definieren, die bei der Datenanalyse in der Datenverarbeitungssoftware verwendet werden. Die Komplexität des Elektrospray-Ionisations-Massenspektrums, bei dem mehrere Metabolit-Merkmale detektiert werden und denselben Metaboliten repräsentieren, wird in Abschnitt 8 besprochen.
Die Gasphasenfragmentierung von Metaboliten wird angewendet, um ein MS/MS-Massenspektrum zu erzeugen, das für die chemische Struktur des Metaboliten repräsentativ ist, da unterschiedliche chemische Strukturen unterschiedliche MS/MS-Spektren erzeugen. Das MS/MS-Spektrum ist von der chemischen Struktur abhängig und kann (idealerweise in Kombination mit einer chromatographischen Trennung) zur Identifizierung verschiedener Isomere verwendet werden, die die gleiche m/z aufweisen. Es können zwei verschiedene Arten von MS/MS-Daten erfasst werden, die datenabhängige Analyse (DDA) und die datenunabhängige Analyse (DIA/SWATH) . DDA ist der traditionell anzuwendende Ansatz, bei dem ein Prescan-Massenspektrum erfasst wird, aus dem eine Anzahl von m/z-Peaks ausgewählt wird, die isoliert werden (typischerweise in einem Quadrupol-Massenanalysator), gefolgt von einer Fragmentierung in einer Kollisionszelle und einer anschließenden Massenanalyse, um das MS/MS-Produktion-Massenspektrum zu erfassen. Die Auswahl eines einzelnen oder mehrerer m/z-Peaks, die isoliert und in Serie fragmentiert werden sollen, basiert typischerweise auf der Intensität, wobei das m/z mit der höchsten Intensität zuerst isoliert und fragmentiert wird. Dies wird beim oberen „n“-Ansatz definiert, wobei n die Anzahl der verschiedenen m/z-Peaks ist, die zwischen jeder Full-Scan-Akquisition fragmentiert werden. Eine Reihe von Regeln kann rechnerisch angewendet werden, um sicherzustellen, dass (1) eine wiederholte Erfassung desselben m/z-Isolationsfensters nicht durch eine Wiederholungszählung beobachtet wird; (2) chemische Rauschpeaks nicht durch Verwendung einer vordefinierten Ausschlussliste fragmentiert werden; (3) Metaboliten durch Verwendung einer Einschlussliste fragmentiert werden. Eine Isolationsbreite wird vom Analytiker definiert und beträgt typischerweise ± 1 oder 2 Da. Daher kann ein einzelner oder mehrere Metaboliten isoliert und fragmentiert werden und ein zusammengesetztes MS/MS-Massenspektrum erzeugt werden. Eine Isolationsbreite von > 1,0 Da ermöglicht es, dass 13C-Isotopenpeaks (13C, ein stabiles Isotop, ist in natürlicher Häufigkeit zu etwa 1,1 % vorhanden) in den Fragmentierungsprozess einbezogen werden und 13C-Isotopeninformationen im MS/MS-Massenspektrum beobachtet werden können. Die Reinheit des Isolationsfensters wird normalerweise nicht beim Abgleich von experimentellen MS/MS-Spektren mit MS/MS-Spektren berücksichtigt, die in Massenspektralbibliotheken verfügbar sind und durch die Analyse von reinen, authentischen chemischen Standards gewonnen wurden. Eine Software zur Berechnung der Reinheit von MS/MS-Massenspektren (msPurity) wurde kürzlich entwickelt und hat gezeigt, dass eine durchschnittliche Reinheit von 70 % oder mehr routinemäßig in ungezielten metabolischen Phänotypisierungsstudien beobachtet wird. Obwohl DDA die am häufigsten angewandte Methode ist, hat sie Einschränkungen: (1) MS/MS-Massenspektren für alle Metaboliten werden bei Analysen von 15 Minuten Länge nicht erfasst; (2) verschiedene Ionenarten (z. B. protonierte und sodiierte Addukt-Ionen) desselben Metaboliten können beide für die Fragmentierung ausgewählt werden, obwohl nur eine Ionenart erforderlich ist; (3) die Art des fragmentierten Ions ist nicht intelligent definiert, obwohl verschiedene Ionenarten leichter und informativer fragmentieren können (z. B., ein protoniertes Ion wäre geeigneter und informativer als ein natriumhaltiges Addukt-Ion, das durch den Verlust des Natrium-Ions fragmentiert, wobei keine andere signifikante Fragmentierung beobachtet wird). Die Kollisionsenergie, die angewandt wird, um ein informatives MS/MS-Spektrum zu erhalten, ist auch von der chemischen Struktur abhängig, keine einzelne Kollisionsenergie ist für alle Metaboliten geeignet und stattdessen sollte ein breiter Bereich von Kollisionsenergien angewandt werden. Es können verschiedene Ansätze angewandt werden, um die Anzahl der erhaltenen informativen MS/MS-Spektren zu maximieren. Der erste Ansatz wendet mehrere Kollisionsenergien für die Fragmentierung desselben Metaboliten an, gefolgt von der Kombination mehrerer MS/MS-Spektren zu einem einzigen zusammengesetzten MS/MS-Massenspektrum, was als gestufte Kollisionsenergien definiert wird. Der zweite Ansatz wendet die gleiche Kollisionsenergie für eine einzelne Probeninjektion an, wendet aber eine unterschiedliche Kollisionsenergie für verschiedene Probeninjektionen an . Dadurch können kollisionsenergiespezifische MS/MS-Spektren aufgenommen werden. Die größte Einschränkung der DDA-Datenerfassung besteht jedoch darin, dass bei ungezielten Studien nicht für alle Metaboliten ein MS/MS-Massenspektrum erfasst wird.
Um die reduzierte Abdeckung von Metaboliten mit MS/MS-Daten zu überwinden, die bei der Anwendung von DDA erfasst werden, kann ein alternativer Ansatz angewendet werden, der als datenunabhängige Analyse bezeichnet wird; dieser wird auch als SWATH bezeichnet. Wie der Name schon sagt, ist die MS/MS-Datenerfassung unabhängig von den Daten und den bei DDA angewandten Regeln. Stattdessen werden breitere Isolationsfenster angewendet (z. B. 25 Da) und ein MS/MS-Massenspektrum wird für alle in jedem Isolationsfenster vorhandenen Ionen in Serie über den gesamten m/z-Bereich erfasst. Dieser Ansatz stellt sicher, dass ein MS/MS-Massenspektrum für alle Metaboliten erfasst wird, obwohl das MS/MS-Massenspektrum eine Zusammensetzung aus mehreren Metaboliten oder chemischen Rauschionen sein kann und daher ein MS/MS-Spektrum geringerer Reinheit erstellt wird. Die Auflösung von chromatographischen Peaks, die nicht zusammengesetzt sind, kann zur rechnerischen Ableitung des MS/MS-Massenspektrums für jeden einzelnen Metaboliten verwendet werden. Das Massenspektrum kann zur Metabolit-Annotation oder zur Quantifizierung verwendet werden, da MS/MS-Daten kontinuierlich für alle Metaboliten erfasst werden. Um die DIA-Datenerfassung zu ermöglichen, werden Massenspektrometer mit schnellen Scan-Geschwindigkeiten oder UPLC mit breiteren chromatographischen Peaks benötigt, um sicherzustellen, dass eine angemessene Anzahl von Full-Scan-Datenpunkten über einen chromatographischen Peak in Kombination mit bis zu 40 ebenfalls erfassten DIA-Fenstern erfasst wird. DIA-Methoden sind aus der Entwicklung der SWATH-Technologien durch Aebersold hervorgegangen, die anschließend von Sciex kommerzialisiert wurde, zunächst für proteomische Anwendungen und in jüngerer Zeit für metabolomische Anwendungen . Andere Geräteplattformen bieten ebenfalls DIA-Fähigkeiten. In der Proteomik wird typischerweise eine DIA-Bibliothek verwendet, die aus den MS/MS-Massenspektren aller möglichen Proteine/Peptide besteht, um die Genauigkeit des Entfaltungsschritts zu unterstützen und zu erhöhen, indem nach jedem Massenspektrum gesucht wird. Dies kann durchgeführt werden, wenn das komplette Proteom bekannt ist und die in silico-Konstruktion der MS/MS-Bibliotheken durchgeführt wurde. Für die metabolische Phänotypisierung sind jedoch derzeit nicht alle erwarteten Metaboliten bekannt, der Mangel an authentischen chemischen Standards ist einschränkend und in silico-Ansätze für die genaue Vorhersage von MS/MS-Massenspektren sind derzeit begrenzt. Daher kann dieser Ansatz für eine Teilmenge bekannter Metaboliten mit einer MS/MS-Bibliothek angewandt werden, oder es kann ein ungezielter DIA-Ansatz angewandt werden, bei dem die Dekonvolution abhängig oder unabhängig von einer MS/MS-Bibliothek durchgeführt wird (z. B. unter Anwendung von MS-DIAL ).
Einige Methoden wenden einen m/z-Bereich für das Isolationsfenster an, der identisch mit dem m/z-Bereich des vollständigen Scans ist, was dazu führt, dass alle Ionen in diesem großen Isolationsfenster fragmentiert werden und ein komplexes MS/MS-Massenspektrum erzeugt wird, das eine rechnerische Dekonvolution erfordert. Waters-Plattformen können MSE anwenden, bei der abwechselnd eine niedrige und eine hohe Kollisionsenergie angewendet wird, um Full-Scan-Daten und MS/MS-Daten für alle Ionen zu jedem Zeitpunkt zu sammeln, und Thermo Scientific-Plattformen können All Ion Fragmentation (AIF) anwenden. Die chromatographische Auflösung der Metaboliten und die Scangeschwindigkeit können die Genauigkeit des Entfaltungsschritts und die Reinheit der MS/MS-Massenspektren von Einzelmetaboliten erheblich beeinflussen.