¿Existen bacterias pleomórficas de origen natural en la sangre de seres humanos sanos?

En nuestra búsqueda de espiroquetas implicadas en la enfermedad de Alzheimer (13), observamos bacterias pleomórficas en la sangre de sujetos humanos sanos mediante microscopía de campo oscuro. Se trata de un hallazgo sorprendente, ya que en general se reconoce que el torrente sanguíneo de los seres humanos sanos es un entorno estéril (7), excepto cuando se produce una ruptura en la integridad de las membranas de los tejidos (6). Sin embargo, el concepto de la presencia de bacterias en la sangre de humanos sanos es ahora más plausible debido a los enfoques de laboratorio independientes del cultivo. Las principales técnicas empleadas en estos estudios incluyen la amplificación por PCR y la secuenciación del ADN ribosómico 16S (ADNr). Estos métodos han revelado la presencia de una gran diversidad de microorganismos en el medio ambiente y, de hecho, dentro del cuerpo humano (12). En este informe presentamos pruebas basadas en técnicas filogenéticas moleculares y en la microscopía óptica y electrónica, así como en otros métodos microbiológicos convencionales, de la existencia de una población de bacterias en la sangre humana sana. En vista de la aparente naturaleza controvertida de nuestros hallazgos, fue alentador observar el reciente informe de Nikkari et al. (14), quienes detectaron secuencias de ADNr bacterianas asociadas a la sangre utilizando métodos de PCR en tiempo real y una sonda dirigida a regiones conservadas del ADNr bacteriano 16S, y un informe anterior de Tedeshi et al. (16) sobre la presencia de bacterias pleomórficas como parásitos intraeritrocíticos en sujetos humanos clínicamente sanos.

Para el examen microscópico de la luz, se extrajeron muestras de sangre de 25 voluntarios sanos en un tubo Vacutainer sin anticoagulantes (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.); la sangre se extrajo de la manera convencional que implica la antisepsia de la piel y la evitación de cualquier introducción de microorganismos externos por contaminación. (Dado que la contaminación externa era siempre una posibilidad, se tuvo especial cuidado y precaución en todo momento para evitarla. Los procedimientos específicos, así como los controles adecuados, se especifican a lo largo del texto). Se examinó un montaje húmedo del suero de la sangre coagulada de cada muestra, fresca o incubada a 30°C durante entre 5 y 7 días, mediante microscopía de campo oscuro (Leitz Dialux 20) para detectar bacterias pleomórficas.

Para la amplificación de la PCR, se utilizó una alícuota de 0,5 ml de la sangre incubada que contenía bacterias pleomórficas para la extracción convencional de ADN por el método de Higuchi (11). Se utilizaron tres microlitros del extracto para la amplificación del ADN por el método de Edwards et al. (8) utilizando el cebador delantero BSF8/20 (5′-AGAGTTTGATCCTGCTCAG-3′) y el cebador inverso BSR1541/20 (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′).Se realizaron treinta ciclos de PCR, con un ciclo que constaba de los siguientes pasos: (i) desnaturalización (1 min a 94°C), (ii) recocido (30 s a 70°C) y (iii) extensión (90 s a 72°C). Se utilizó la ADN polimerasa Vent (New England BioLabs, Mississauga, Ontario, Canadá) debido a su capacidad de corrección de pruebas.

Los amplicones se resolvieron mediante electroforesis en gel estándar y se detectaron mediante tinción con bromuro de etidio. El ADN se purificó utilizando el kit Geneclean II (Bio 101, Inc., La Jolla, California), y el ADN se clonó en el sitio SmaI del vector pBluescript II (Stratagene, La Jolla, California). El análisis de la secuencia de nucleótidos de dos clones elegidos al azar se realizó utilizando el secuenciador de ADN automatizado ABI (modelo 373A) y los kits de secuenciación cíclica ABI Prism con la polimerasa AmpliTaq FS (Perkin-Elmer Corp., Boston, Mass.).

El gen gyrB se amplificó por PCR mediante el protocolo descrito por Yamamoto y Harayama (21). Los amplicones se clonaron utilizando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, California).

Los datos de las secuencias se analizaron utilizando el programa BLASTN del National Center for Biotechnology Information (Bethesda, Md.) (1). Las secuencias candidatas con las puntuaciones más altas se recuperaron en consecuencia y se alinearon mediante el programa NALIGN de PC/Gene (Intelligenetics, Inc.).

Para realizar la hibridación in situ fluorescente (FISH), se extrajo sangre en las condiciones asépticas idénticas habituales (para evitar la contaminación) de tres sujetos sanos y se incubó durante 6 días a 30°C en tubos de vidrio interiores estériles marca Vacutainer (16 por 100 mm). La muestra de sangre se diluyó 1:10 con una solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con 10 mM de pirofosfato. La muestra se centrifugó durante 5 s y luego se filtró a través de un filtro de jeringa Acrodisc estéril de 0,8 μm de tamaño de poro para eliminar los glóbulos rojos y los residuos. Se centrifugaron alícuotas de un mililitro de la muestra durante 10 minutos a 14.000 × g. Los procedimientos posteriores de fijación e hibridación se realizaron mediante el protocolo descrito por Thomas et al. (17). Brevemente, las células bacterianas pelleteadas se fijaron con 1 ml de paraformaldehído al 3% (p/vol) recién preparado a 4°C durante 24 h. A continuación, las células se pelletearon durante 10 min a 14.000 × g y se permeabilizaron incubando el pellet con 1 ml de una mezcla fría de etanol y PBS (1:1, vol/vol) durante 5 min a 25°C. Las bacterias se lavaron con PBS y se resuspendieron en 50 μl de tampón de hibridación (0,9 M NaCl, 20 mM Tris ) que se precalentó a 50°C y se complementó con 10 ng de sondas fluorescentes por μl. Las sondas utilizadas fueron todas oligonucleótidos marcados con fluoresceína dirigidos al ARNr: la sonda eubacteriana (EUB) BSR1541/20 (8); la no EUB, que es complementaria a la sonda bacteriana universal EUB utilizada como control negativo de inespecificidad (3); y la sonda eucariótica EUK (18). Las suspensiones se incubaron durante 24 horas a 50°C, y la hibridación se detuvo centrifugando las muestras durante 2 minutos a 8.000 × g, desechando el sobrenadante y añadiendo 1 ml de PBS. Se añadió bromuro de etidio (0,5 μg/ml) justo antes del análisis por citometría de flujo.

Para la microscopía electrónica, las células bacterianas de las muestras de sangre incubadas de sujetos sanos se separaron de los elementos sanguíneos mediante el siguiente método. Una dilución 1:10 de sangre en PBS se centrifugó en una microcentrífuga a 14.000 × g durante 5 s. Se extrajo el sobrenadante y se centrifugó como se ha descrito anteriormente durante 10 min. Se decantó y el pellet se lavó dos veces en PBS. El pellet que contenía una alta concentración de bacterias de la sangre se resuspendió en un pequeño volumen final de PBS. Alternativamente, la sangre diluida 1:10 en PBS se filtró a través de un filtro de membrana de 0,45 μm de tamaño de poro. El filtrado se centrifugó a 14.000 × g durante 10 minutos, y el pellet se lavó dos veces con PBS. Este pellet también se resuspendió en un pequeño volumen de PBS para la microscopía electrónica. Se realizó una tinción negativa con ácido fosfotúngstico al 2%. Para preparar el seccionamiento ultrafino, las células se fijaron en glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato 0,1 M durante 2 horas. Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron utilizando el microscopio electrónico de transmisión (TEM) JEOL 2000 FX.

Aspirados por nuestra observación de lo que parecía ser un microbio inusual en una muestra de sangre de un individuo sano, analizamos varias muestras de sangre para detectar la presencia de bacterias mediante la amplificación por PCR del ADNr 16S utilizando cebadores universales. No se detectó ningún producto de la sangre del día 0 (mediante tinción con bromuro de etidio), pero el producto de la PCR fue detectable después de que la sangre se hubiera incubado a 30°C durante 5 días. La inoculación de alícuotas de muestras de sangre del día 0 o del día 5 en caldo nutritivo no dio lugar a ningún crecimiento bacteriano. Evidentemente, la señal de PCR obtenida no era resultado de una contaminación bacteriana saprofita.

Se clonaron fragmentos de ADN amplificados por PCR con tamaños de 1,2 y 1,5 kb de estas bacterias. Se utilizaron dos plásmidos recombinantes, B16 y T5, para la secuenciación del ADN. Las dos secuencias eran idénticas excepto por un extremo 5′ truncado en B16. El gen del ARNr 16S casi completo de T5 (1.257 pb) mostró una identidad del 99,6% con la secuencia de 1.500 pb de Stenotrophomonas maltophilia LMG958T, una cepa tipo de la colección de cultivos del Laboratorium voor Microbiologie Gent, Gante, Bélgica. La secuencia de T5 determinada en ambas cadenas mostró cuatro transiciones y dos transversiones en comparación con la secuencia de LM958T (número de acceso del GenBank X95923). Este hallazgo se ha confirmado con una segunda muestra de otro sujeto. (La posición filogenética de S. maltophilia ha sido objeto de una intensa investigación. Originalmente se llamaba Pseudomonas maltophilia, pero posteriormente se denominó Xanthomonas maltophilia. S. maltophilia se agrupa en la subclase gamma de las Proteobacterias y representa un taxón distinto.)

Uno de nosotros (M. Sirois) logró la amplificación independiente del ADNr 16S de muestras de sangre de otros tres sujetos en la Universidad de Quebec en Trois-Rivieres (Canadá). El análisis de la secuencia del gen ribosómico 16S de las muestras de sangre de estos tres sujetos mostró que el género bacteriano de mayor homología era Pseudomonas. Esto apoyó nuestros hallazgos en la Universidad McGill, ya que Stenotrophomonas, como se ha indicado anteriormente, formaba parte del género Pseudomonas.

Además de los resultados del ARNr 16S obtenidos en la Universidad McGill, también hemos amplificado por PCR el gen gyrB de las bacterias de las muestras de sangre. El gen gyrB codifica la proteína de la subunidad B de la ADN girasa. La amplificación por PCR del gen gyrB es un nuevo método molecular para detectar e identificar cepas bacterianas (21). La secuencia del fragmento de PCR de 475 pb, que obtuvimos en nuestro laboratorio, resultó ser diferente de la del gen gyrB parcial (1.252 pb) de la cepa tipo de S. maltophilia ATCC 13637. Por tanto, el aislado que aislamos de la sangre no es idéntico a S. maltophilia ATCC 13637, sino que se trata de otra cepa.

También se realizó FISH de las bacterias de la sangre (2, 4). Descubrimos que los métodos convencionales de FISH de células enteras utilizando la sonda de oligonucleótidos marcada con fluoresceína BSR1541/20 (complementaria a una región en el extremo 3′ del ARNr 16S conservada para todas las eubacterias) no eran adecuados debido a la lisis de las frágiles bacterias. Para evitar este problema, la suspensión bacteriana de la sangre se estudió mediante un protocolo FISH y citometría de flujo láser (LFC) (3, 17). Esta técnica tiene el potencial de analizar rápidamente las bacterias viables pero no cultivables.

La figura 1A muestra el perfil de dispersión de luz de la suspensión bacteriana registrado por LFC que refleja las células y los posibles desechos y el ruido de fondo. Se ha delimitado una región (región a) de este perfil en la que se han registrado eventos fluorescentes. Las señales fluorescentes emitidas por las células que hibridaron con la sonda inespecífica marcada con fluoresceína (no EUB) (intensidad fluorescente media de 3,9) se muestran en la Fig. 1B. Las IMFs registradas en la región e en muestras de sangre tomadas de tres individuos diferentes en 2 días distintos fueron de 2,5 a 3,7 veces mayores con la sonda BSR1541/20 que las obtenidas con la sonda no EUB (Tabla 1). Las señales fluorescentes de la sonda EUK marcada con fluoresceína (17), específica para una región del ARNr 18S conservada en todos los eucariotas, no fueron diferentes de las de la sonda no EUB.