Significado clínico de un aloanticuerpo contra la glicoproteína del grupo sanguíneo Kell

Tabla 1

Una muestra de sangre periférica del probando fue enviada a nuestro laboratorio de referencia debido a la presencia de un aloanticuerpo IgG RBC que reaccionó (3+) con todos los RBC del panel en la fase de antiglobulina humana en solución de baja fuerza iónica y con glóbulos rojos modificados con papaína. El suero materno no reaccionó cuando se analizó con glóbulos rojos tratados con ditireitol o con EDTA/ácido glicínico. El título del anticuerpo contra los glóbulos rojos ABO-compatibles de su marido fue de 128. Se realizó la tipificación eritrocitaria ampliada mediante la técnica del tubo , y se identificó el siguiente fenotipo C+ c+ E- e+; M+ N- S- s+; Fy(a+ b+); Jk(a+ b-); Lu(a- b+); Le(a- b+); K- k-; Kp(a- b-); Js(a- b-). Los glóbulos rojos de la paciente fueron negativos para todos los antígenos del grupo sanguíneo Kell estudiados. El DAT y el autocontrol fueron negativos tanto por el método del tubo convencional como por la prueba del gel. En conjunto, estos resultados sugieren un posible fenotipo K₀ con la presencia de un aloanticuerpo anti-Ku. En ocasiones, es difícil distinguir por serología entre un fenotipo K₀ y un fenotipo Kmod. La detección de los antígenos Kell depende en gran medida de la avidez de los reactivos que se utilicen; por lo tanto, a veces es un reto establecer los límites entre una aglutinación débilmente positiva y una negativa. Teniendo en cuenta esto, la posibilidad de un fenotipo Kmod con un anticuerpo similar al Ku no puede descartarse hasta que se lleven a cabo investigaciones moleculares.

El genotipo KEL se realizó en el ADN genómico materno mediante estrategias de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y mostró los genotipos KEL*02/02, KEL*04/04 y KEL*07/07. Debido a la discrepancia entre los hallazgos serológicos y moleculares, se secuenció cada uno de los 19 exones del gen KEL y los límites entre intrones y exones mediante el método Sanger dideoxy . Los cromatogramas mostraron una sustitución homocigótica de una guanina por una adenina en el primer nucleótido del intrón 3 (IVS3 + 1g>a) cambiando la secuencia conservada gt en el sitio de empalme 5ʹ por at. Este evento provoca un empalme aberrante del ARN, alterando el marco de lectura e introduciendo un codón de parada prematuro que impide la expresión de la glicoproteína Kell en la membrana de los glóbulos rojos . Los datos de secuenciación proporcionados por el Exome Aggregation Consortium , obtenidos de 60.706 individuos no emparentados de diversas etnias, mostraron que la mutación IVS3 + 1g>a (acceso dbSNP: rs369569464) tiene una frecuencia de 8,29 × 10-5 y se encontró en poblaciones europeas (no finlandesas), europeas (finlandesas), latinas y del sur de Asia. La variante IVS3 + 1a, denominada alelo KEL*02N.06 por la Sociedad Internacional de Transfusión Sanguínea, es una de las bases genéticas más frecuentes del fenotipo K₀, extremadamente raro. El análisis molecular confirmó que el probando tenía el fenotipo K₀, y es altamente sugerido que la especificidad del aloanticuerpo encontrado en el suero del paciente era efectivamente un anti-Ku.

Los miembros de la familia del probando fueron investigados por métodos serológicos y moleculares con el fin de proporcionarles un asesoramiento adecuado en relación con la aloinmunización después de la transfusión y/o el embarazo. Se desarrolló una estrategia de PCR con cebador de secuencia específica (SSP) para detectar la mutación encontrada en el probando. Se realizaron dos PCRs separadas utilizando un cebador directo (ATCTTTCACCTTGGTTCCCC) complementario a una secuencia consenso del gen KEL emparejado con cebadores inversos que contenían en su 3ʹ extremos (posición IVS3 + 1) los nucleótidos polimórficos C (GGGGTCTGGGATCTTGCTTAC) para anillar con G en el alelo tipo KELwild o T (GGGGTCTGGATCTTGCTTAT) para anillar con A en el KEL*02N.06 en cada reacción. Para establecer las condiciones óptimas de PCR, se utilizaron muestras de ADN del paciente (genotipo KEL*02N.06/KEL*02N.06) y de un individuo normal (genotipo KEL*01/KEL*02). Las amplificaciones se realizaron con aproximadamente 0,5 μg de ADN genómico en un volumen final de 10 μl que contenía 0,4 μmol/l de cada cebador (excepto los cebadores utilizados para los controles positivos internos que estaban a 0,04 μmol/l), 0,2 mmol/l de cada dNTP, 2 mmol/l de MgCl2 y 1 U de Taq ADN polimerasa en el tampón apropiado. La PCR se inició con un ciclo de desnaturalización a 94 °C durante 5 min y se terminó con un ciclo de 10 min a 72 °C para completar la extensión. Los parámetros del ciclo fueron 30 ciclos de 40 s a 94 °C, 40 s a 67 °C para el recocido y 40 s a 72 °C para la extensión. En todas las reacciones de PCR se utilizó un par de cebadores que amplifican una secuencia consenso del gen de la hormona de crecimiento humana como control positivo interno. Los productos de la PCR (435 pb para el control positivo interno y 192 pb para los productos específicos) se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 2%. Esta estrategia permite la detección del alelo KEL*02N.06 en dosis doble o única. Los resultados serológicos y de PCR-SSP (fig. 1) demostraron que siete miembros de la familia (madre, padre, 2 hermanas, 1 hermano y 2 hijos) expresan los antígenos k, Kpb y Jsb y son portadores de una dosis única del alelo KEL*02N.06.

Discusión

Los estudios moleculares realizados en la muestra del probando permitieron identificar el alelo responsable de un fenotipo K₀ (KEL*02N.06) en homocigosis y apoyan la conclusión de que la especificidad del aloanticuerpo encontrado en la madre era anti-Ku.

Los anticuerpos contra antígenos del sistema del grupo sanguíneo Kell suelen ser IgG y pueden estar implicados en las reacciones hemolíticas transfusionales y en la HDFN . Algunas especificidades, como el anti-K y el anti-Kpa, se han asociado no sólo a la destrucción mediada por IgG de los glóbulos rojos maduros, sino también a la supresión de la eritropoyesis al promover la destrucción inmunitaria de las células progenitoras tempranas eritroides por parte de los macrófagos en el hígado fetal . En cuanto a los anti-Ku, se sabe poco sobre su importancia clínica debido a que los individuos sensibilizados a los K₀ son raros. Aunque algunos autores han descrito que el anti-Ku produce reacciones transfusionales hemolíticas y HDFN, otros han observado la ausencia de hemólisis atribuida a esta especificidad . En nuestro caso, los hallazgos de laboratorio y el curso clínico del recién nacido fueron consistentes con la destrucción inmunomediada de glóbulos rojos. La hiperbilirrubinemia encontrada en el recién nacido aumentó progresivamente alcanzando un pico en el tercer día de vida mientras que, concomitantemente, los valores de hematocrito y hemoglobina disminuyeron, mostrando una anemia moderada. Teniendo en cuenta que la madre y el bebé eran ABO-idénticos, el aumento de los valores de bilirrubina no puede atribuirse a la incompatibilidad ABO, sino a la acción del aloanticuerpo anti-Ku, que a su vez depende de la subclase de IgG implicada. Es bien sabido que las IgG1 y las IgG3 interactúan eficazmente con la mayoría de los receptores Fcγ de las células fagocíticas, mientras que las IgG2 y las IgG4 muestran una afinidad reducida con la mayoría de ellos. En consecuencia, la tasa de eliminación de los eritrocitos sensibilizados de la circulación depende de la subclase de IgG del anticuerpo unido a la membrana del glóbulo rojo. Lamentablemente, no se pudo realizar la determinación de la subclase de IgG, sin embargo, los hallazgos clínicos y de laboratorio sugieren que en nuestro caso la hiperbilirrubinemia y la anemia del recién nacido fueron causadas por la destrucción inmunológica de los glóbulos rojos debido al aloanticuerpo IgG1 y/o IgG3 anti-Ku. Cabe destacar que el hematocrito y el nivel de hemoglobina al nacer eran normales, y el recuento de reticulocitos en el día 3 reflejaba la producción de glóbulos rojos en respuesta a la anemia. Estas observaciones sugieren que el anti-Ku materno no causó un efecto supresor de la eritropoyesis fetal durante el embarazo, como se ha descrito para otras especificidades dentro del sistema del grupo sanguíneo Kell . De lo contrario, los parámetros asociados a la producción de glóbulos rojos habrían estado notablemente disminuidos en el recién nacido.

El bebé fue tratado brevemente con fototerapia y dado de alta a su casa el día 5 en buen estado. La anemia del bebé se resolvió después de 4 meses sin requerir transfusión de sangre, y la hemoglobina se mantuvo dentro del rango normal. Al año de edad, la evaluación neurológica del bebé fue normal, sin mostrar ningún daño causado por la hiperbilirrubinemia.

Estudiamos además a los miembros de la familia del probando para proporcionarles un asesoramiento adecuado en relación con la transfusión y los posibles eventos de aloinmunización. Aunque son ABO-compatibles con el probando, no se encontraron individuos homocigotos KEL*02N.06 que carecieran de la expresión del antígeno Kell. Estos resultados demuestran que los miembros de la familia no son donantes compatibles con respecto al sistema Kell. En consecuencia, se deben implementar programas de autotransfusión en el paciente en caso de necesidad. En caso contrario, debe seguirse un protocolo de transfusión de alto riesgo indicado sólo para situaciones extremas. Los hallazgos serológicos y moleculares nos permitieron informar a los familiares de la paciente estudiada, principalmente a sus dos hermanas, de que no tienen riesgo de desarrollar un anti-Ku.

En resumen, nuestro caso aporta una valiosa información sobre los hallazgos serológicos, moleculares y clínicos en relación con la HDFN asociada a un aloanticuerpo anti-Ku producido por una gestante K₀. A pesar de que el anticuerpo se dirigía contra el sistema del grupo sanguíneo Kell, el recién nacido fue tratado con éxito con fototerapia, y no fue necesaria ninguna exanguinotransfusión. Los estudios integrados de fenotipo y genotipo permitieron recomendaciones médicas precisas para la probanda y su grupo familiar.

Aprobación ética

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes.

Agradecimientos

Agradecemos a Cecilia Siniscalchi su ayuda en los análisis de laboratorio.

Declaración de divulgación

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses relevantes para el manuscrito presentado.

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