Clinical Significance of an Alloantibody against the Kell Blood Group Glycoprotein

Summary

Achtergrond: Kell null (K0) personen kunnen anti-Ku produceren, een antilichaam tegen vele epitopen in het Kell glycoproteïne, na transfusie en/of zwangerschap. Aangezien gesensibiliseerde K0 patiënten zeldzaam zijn, is er weinig bekend over de klinische relevantie van anti-Ku en in het bijzonder over de associatie met hemolytische ziekte van de foetus en de pasgeborene. Casusverslag: Dit werk beschrijft een geval van neonatale hyperbilirubinemie ten gevolge van immuungemedieerde erytrocytdestructie door een allo-antilichaam gericht tegen het Kell-glycoproteïne. Serologische en moleculaire benaderingen identificeerden een anti-Ku alloantilichaam in maternaal serum. Een homozygote IVS3 + 1g> een puntmutatie (KEL*02N.06 allel) bleek verantwoordelijk te zijn voor het ontbreken van Kell antigeenexpressie in de rode bloedcel van de moeder en daaropvolgende alloimmunisatie na een vorige zwangerschap. Hoewel in de meeste gevallen Kell-antilichamen klinisch ernstig zijn en onderdrukking van de erytropoëse kunnen veroorzaken, had de pasgeborene in ons geval een matige anemie en hyperbilirubinemie die met succes werd behandeld met fototherapie zonder dat een wisseltransfusie nodig was. Serologisch en moleculair onderzoek bij familieleden van de proband stelde ons in staat hen goed te adviseren over alloimmunisatie na transfusie en/of zwangerschap. Conclusies: Deze casus vergroot het begrip van de klinische betekenis van alloantistoffen tegen Kell bloedgroepantigenen.

© 2016 S. Karger GmbH, Freiburg

Inleiding

Het Kell-systeem (ISBT 006) is een van de belangrijkste bloedgroepen in de transfusie en verloskundige geneeskunde. Het is zeer immunogeen, en Kell antilichamen worden beschouwd als klinisch significant. Het Kell-bloedgroepsysteem omvat 35 antigenen, waarvan K/k (KEL1/KEL2), Kpa/Kpb (KEL3/KEL4), en Jsa/Jsb (KEL6/KEL7) de belangrijkste zijn. De expressie van Kell-antigenen wordt bepaald door verschillende allelen van het KEL-gen dat is georganiseerd in 19 exonen. Single nucleotide polymorfismen zijn de meest voorkomende oorzaak van verschillende Kell fenotypes. Kell-antigenen komen tot uitdrukking op het type II Kell-glycoproteïne dat het membraan van de rode bloedcel (RBC) eenmaal omspant en door een enkele disulfidebinding is verbonden met het XK-eiwit, een integraal membraanpolypeptide dat het Kx-bloedgroepantigeen (XK1) tot uitdrukking brengt. De afwezigheid van het XK-eiwit leidt tot het Mc Leod-syndroom, dat wordt gekenmerkt door neuromusculaire afwijkingen, milde hemolyse en acanthocytose van de RBC’s met een sterk verminderde hoeveelheid Kell-eiwit en al zijn antigenen (Mc Leod-fenotype).

Nucleotideveranderingen in het KEL-gen kunnen leiden tot stille allelen (K0-allelen) die verantwoordelijk zijn voor het ontbreken van de expressie van het Kell-antigeen, het zogenaamde Kell-nul fenotype (K₀-fenotype). Momenteel is van ten minste 37 verschillende K0-allelen in een schaars aantal individuen vastgesteld dat zij de expressie van Kell-antigeen opheffen wanneer zij homozygoot of samengestelde heterozygoot zijn. Daarnaast leiden verschillende nucleotide veranderingen in het KEL-gen tot verminderde of zwakke Kell antigenen, wat het Kmod fenotype wordt genoemd.

Het ontbreken van Kell glycoproteïne in K₀ individuen leidt niet tot een herkenbare ziekte; wel kunnen zij anti-Ku (anti-KEL5) produceren, een antilichaam tegen vele epitopen in het gehele polypeptide, na transfusie en/of zwangerschap. Aangezien gesensibiliseerde K₀ patiënten zeldzaam zijn, is er weinig bekend over de klinische relevantie van anti-Ku en in het bijzonder over het verband met hemolytische ziekte van de foetus en de pasgeborene (HDFN). Terwijl sommige auteurs anti-Ku in verband brachten met ernstige perinatale anemie, vonden anderen geen klinisch bewijs van getroffen zuigelingen. Aan de andere kant zijn anti-Ku-achtige antilichamen beschreven bij personen bij wie de RBC’s als Kmod zijn geclassificeerd. In het volgende gevalsverslag beschrijven we de klinische relevantie van een anti-Ku die werd gevonden bij een K₀ puerpera.

Gevalverslag

Een 21-jarige, gravida 2, para 1, Argentijnse, bloedgroep A RhD-positieve vrouw werd in het ziekenhuis opgenomen tijdens de bevalling, bij 40 weken van een niet-onderzochte zwangerschap. De vrouw verwees niet naar eerdere abortussen noch transfusies en beviel van een bloedgroep A RhD-positieve baby, die 3,320 kg woog, duidelijke hyperbilirubinemie had (totaal bilirubine 6,32 mg/dl) en een positieve (4+) directe antiglobulinetest (DAT). De pasgeborene werd onmiddellijk behandeld met fototherapie. De totale bilirubinewaarden stegen progressief. Er werden geen compatibele RBC’s met maternaal serum gevonden voor verwisseltransfusie. Gewassen maternale RBC’s werden bereid maar niet gebruikt omdat de totale bilirubine geleidelijk begon te dalen op dag 3. Tabel 1 geeft een overzicht van de evolutie en laboratoriumbevindingen van de pasgeborene tijdens de ziekenhuisopname.

Een perifeer bloedmonster van de proband werd naar ons referentielaboratorium gestuurd vanwege de aanwezigheid van een IgG RBC-legerantilichaam dat reageerde (3+) met alle RBC’s in het anti-humaan globuline fase in oplossing met lage ionensterkte en met papaïne gemodificeerde RBC’s. Het serum van de moeder was niet reactief wanneer het werd getest met met dithiothreitol behandelde of met EDTA/glycinezuur behandelde RBC’s. De titer van het antilichaam tegen de ABO-compatibele RBC’s van haar echtgenoot was 128. Uitgebreide erytrocyt typering werd uitgevoerd met behulp van buisjes techniek , en het volgende fenotype werd geïdentificeerd: C+ c+ E- e+; M+ N- S- s+; Fy(a+ b+); Jk(a+ b-); Lu(a- b+); Le(a- b+); K- k-; Kp(a- b-); Js(a- b-). De RBC’s van de patiënt waren negatief voor alle onderzochte Kell-bloedgroepantigenen. DAT en autocontrole waren negatief door zowel de conventionele buisjesmethode als de geltest. Alles bij elkaar suggereerden deze resultaten een potentieel K₀ fenotype met de aanwezigheid van een anti-Ku alloantilichaam. Soms is het moeilijk om door serologie onderscheid te maken tussen een K₀ en een Kmod fenotype. De opsporing van Kell-antigenen hangt in hoge mate af van de aviditeit van de gebruikte reagentia; daarom is het soms een uitdaging om de grenzen tussen een zwak positieve agglutinatie en een negatieve vast te stellen. Daarom kan de mogelijkheid van een Kmod fenotype met een anti-Ku achtig antilichaam niet worden genegeerd totdat moleculair onderzoek is uitgevoerd.

KEL genotypering werd uitgevoerd in maternaal genomisch DNA door middel van polymerase kettingreactie (PCR) restrictie fragmentlengte polymorfisme strategieën en toonde KEL*02/02, KEL*04/04 en KEL*07/07 genotypen. Wegens de discrepantie tussen de serologische en de moleculaire bevindingen werden elk van de 19 exonen van het KEL-gen en de intron-exon grenzen gesequeneerd met behulp van de Sanger dideoxy-methode . Chromatogrammen toonden een homozygote substitutie van een guanine naar een adenine aan de eerste nucleotide van intron 3 (IVS3 + 1g>a) waarbij de geconserveerde gt-sequentie op de 5ʹ splice site werd gewijzigd in at. Dit veroorzaakt een afwijkende splitsing van het RNA, waardoor het leeskader wordt gewijzigd en een voortijdig stopcodon wordt geïntroduceerd dat expressie van het Kell-glycoproteïne op het RBC-membraan verhindert. Sequentiegegevens verstrekt door het Exome Aggregation Consortium , verkregen van 60.706 niet-verwante personen van diverse etniciteit toonden aan dat de IVS3 + 1g>a-mutatie (dbSNP-toetreding: rs369569464) een frequentie heeft van 8,29 × 10-5 en werd gevonden in Europese (niet-Finse), Europese (Finse), Latino- en Zuid-Aziatische populaties. De IVS3 + 1a variant, door de International Society of Blood Transfusion KEL*02N.06 allel genoemd, is een van de meest frequente genetische bases voor het extreem zeldzame K₀ fenotype. Moleculaire analyse bevestigde dat de proband het K₀ fenotype had, en er wordt sterk gesuggereerd dat de specificiteit van het allo-antilichaam dat in het serum van de patiënt werd aangetroffen in feite een anti-Ku was.

De familieleden van de proband werden onderzocht met serologische en moleculaire methoden om hen goed te kunnen adviseren met betrekking tot allo-immunisatie na transfusie en/of zwangerschap. Een PCR met sequentie-specifieke primer (SSP) strategie werd ontwikkeld om de bij de proband gevonden mutatie op te sporen. Er werden twee afzonderlijke PCR’s uitgevoerd met een voorwaartse primer (ATCTTTCACCTTGGTTCCCC) die complementair is aan een consensussequentie van het KEL-gen, gekoppeld aan omgekeerde primers die op hun 3ʹ uiteinden (positie IVS3 + 1) de polymorfe nucleotiden C (GGGGGTCTGGGATCTTGCTTAC) bevatten voor annealisatie met G in het KELwild type allel of T (GGGGGTCTGGATCTTGCTTAT) voor annealisatie met A in de KEL*02N.06 allel, in elke reactie. Om optimale PCR-condities vast te stellen, werden DNA-monsters van de patiënt (genotype KEL*02N.06/KEL*02N.06) en een normaal individu (genotype KEL*01/KEL*02) gebruikt. Amplificaties werden uitgevoerd met ongeveer 0,5 μg genomisch DNA in een eindvolume van 10 μl dat 0,4 μmol/l van elke primer bevatte (behalve voor primers gebruikt voor interne positieve controles die 0,04 μmol/l bevatten), 0,2 mmol/l van elk dNTP, 2 mmol/l MgCl2 en 1 U Taq DNA-polymerase in de juiste buffer. De PCR’s begonnen met één cyclus van denaturatie bij 94 °C gedurende 5 min en werden afgesloten met één cyclus van 10 min bij 72 °C tot volledige extensie. De cyclusparameters waren 30 cycli van 40 seconden bij 94 °C, 40 seconden bij 67 °C voor annealing en 40 seconden bij 72 °C voor extensie. In alle PCR-reacties werd een primerpaar dat een consensussequentie van het menselijke groeihormoongen amplificeert, gebruikt als interne positieve controle. De PCR-producten (435 bp voor de interne positieve controle en 192 bp voor de specifieke producten) werden geanalyseerd door elektroforese op 2% agarose gels. Deze strategie maakt de detectie van het KEL*02N.06 allel in dubbele of enkele dosis mogelijk. Serologische en PCR-SSP resultaten (fig. 1) toonden aan dat zeven familieleden (moeder, vader, 2 zussen, 1 broer en 2 zonen) k, Kpb en Jsb antigenen tot expressie brengen en drager zijn van een enkele dosis van het KEL*02N.06 allel.

Discussie

Moleculair onderzoek in het monster van de proband maakte de identificatie mogelijk van het allel dat verantwoordelijk is voor een K₀-fenotype (KEL*02N.06) in homozygositeit en ondersteunen de conclusie dat de specificiteit van het bij de moeder gevonden allo-antilichaam anti-Ku was.

Antilichamen tegen antigenen in het Kell bloedgroepensysteem zijn gewoonlijk IgG en kunnen betrokken zijn bij hemolytische transfusiereacties en HDFN . Sommige specifieke kenmerken, zoals anti-K en anti-Kpa, zijn niet alleen in verband gebracht met IgG-gemedieerde vernietiging van rijpe RBC’s, maar ook met onderdrukking van erytropoëse door bevordering van de immuunvernietiging van erythroïde vroege progenitorcellen door macrofagen in de foetale lever. Over de klinische betekenis van anti-Ku is weinig bekend, omdat gesensibiliseerde K₀ personen zeldzaam zijn. Hoewel sommige auteurs beschreven dat anti-Ku hemolytische transfusiereacties en HDFN veroorzaakt, werd het ontbreken van hemolyse toegeschreven aan deze specificiteit door anderen waargenomen. In ons geval waren de laboratoriumresultaten en het klinische beloop van de pasgeborene consistent met immuun-gemedieerde RBC-destructie. De hyperbilirubinemie bij de pasgeborene nam progressief toe en bereikte een piek op de derde levensdag, terwijl tegelijkertijd de hematocriet- en hemoglobinewaarden daalden, wat een matige anemie aantoonde. Aangezien moeder en baby ABO-identiek waren, kan de stijging van de bilirubinewaarden niet worden toegeschreven aan ABO-incompatibiliteit maar aan de werking van het anti-Ku allo-antilichaam, die op haar beurt afhangt van de betrokken IgG-subklasse. Het is bekend dat IgG1 en IgG3 efficiënt interageren met de meeste Fcγ-receptoren op fagocyterende cellen, terwijl IgG2 en IgG4 een verminderde affiniteit voor de meeste van deze receptoren vertonen. Bijgevolg hangt de snelheid waarmee gesensibiliseerde erytrocyten uit de circulatie worden verwijderd af van de IgG-subklasse van het antilichaam dat aan het RBC-membraan is gebonden. Jammer genoeg kon de IgG subklasse niet bepaald worden, maar klinische en laboratorium bevindingen suggereren dat in ons geval de hyperbilirubinemie en anemie van de pasgeborene veroorzaakt werd door de immune destructie van RBC’s ten gevolge van IgG1 en/of IgG3 anti-Ku alloantilichaam. Bij de geboorte waren hematocriet en hemoglobinegehalte normaal, en het aantal reticulocyten op dag 3 weerspiegelde de aanmaak van RBC’s als reactie op anemie. Deze observaties suggereren dat maternale anti-Ku geen suppressief effect veroorzaakte van foetale erytropoëse tijdens de zwangerschap, zoals beschreven voor andere specificiteiten binnen het Kell bloedgroepsysteem.

De baby werd kort behandeld met fototherapie en werd op dag 5 in goede conditie naar huis ontslagen. De bloedarmoede van de baby verdween na 4 maanden zonder dat bloedtransfusie nodig was, en de hemoglobine bleef binnen het normale bereik. Op de leeftijd van 1 jaar was de neurologische evaluatie van de baby normaal, en toonde geen schade veroorzaakt door hyperbilirubinemie.

We onderzochten verder de familieleden van de proband om hen goed te kunnen adviseren over transfusie en mogelijke alloimmunisatie. Hoewel ABO-compatibel met de proband, werden geen KEL*02N.06 homozygote individuen gevonden die geen Kell-antigeenexpressie hadden. Deze bevindingen tonen aan dat gezinsleden geen compatibele donoren zijn wat betreft het Kell-systeem. Bijgevolg moeten autotransfusieprogramma’s bij de patiënt worden geïmplementeerd in geval van nood. Anders moet een hoog-risico transfusie protocol worden gevolgd dat alleen voor extreme situaties is geïndiceerd. De serologische en moleculaire bevindingen stelden ons in staat de onderzochte familieleden van de patiënte, voornamelijk haar twee zusters, te informeren dat zij geen risico lopen op het ontwikkelen van een anti-Ku.

Samenvattend biedt onze casus waardevolle informatie over serologische, moleculaire en klinische bevindingen met betrekking tot HDFN geassocieerd met een anti-Ku alloantilichaam geproduceerd door een K₀ zwangere vrouw. Hoewel het antilichaam gericht was tegen het Kell bloedgroepsysteem, werd de pasgeborene succesvol behandeld met fototherapie, en was er geen wisseltransfusie nodig. Geïntegreerde studies van fenotype en genotype maakten precieze medische aanbevelingen voor de proband en haar familiegroep mogelijk.

Ethische goedkeuring

Verschreven geïnformeerde toestemming van de patiënten werd verkregen.

Erkenning

We zijn Cecilia Siniscalchi dankbaar voor haar hulp bij de laboratoriumanalyses.

Disclosure Statement

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben die relevant zijn voor het ingediende manuscript.

Author Contacts

Artikel / Publicatiedetails