4 soorten gegevens die in UPLC-MS-onderzoeken worden verkregen
UPLC-MS-platforms verkrijgen drie verschillende soorten gegevens via online acquisitie in routinetoepassingen (1) chromatografische retentietijd; (2) full scan nauwkeurige m/z-massaspectra; en (3) MS/MS-spectra. Gegevens over de ionmobiliteit kunnen ook online worden verkregen. Deze vier gegevenstypen kunnen worden toegepast om de chemische structuren te identificeren van metabolieten waarvan de identiteit vóór de gegevensverzameling niet bekend was of om de identiteit te bevestigen van metabolieten waarvan de identiteit vóór de gegevensverzameling bekend was. De verzameling van MSn-gegevens waarbij n > 2 wordt niet routinematig online verworven en in plaats daarvan wordt gebruik gemaakt van fractieverzameling en fractie-infusie gedurende minuten, bijvoorbeeld met behulp van een Triversa Nanomate-systeem, dat lange perioden van infusie mogelijk maakt met gebruikmaking van lage monstervolumes (< 10 μL) .
Het UPLC-systeem en de massaspectrometer genereren complementaire informatie. De chromatografische retentietijd wordt bepaald door de “oplosbaarheid” van de metaboliet in de stationaire en mobiele fasen en zorgt voor scheiding van metabolieten in een complementaire benadering van die toegepast in de massaspectrometer. De voorspelling in silico van retentietijden, bijvoorbeeld op basis van log P-waarden voor omgekeerde fase- en HILIC-toepassingen, wordt binnen de onderzoekgemeenschap ontwikkeld. Verder onderzoek en verdere ontwikkelingen zijn nodig om de in silico retentietijdvoorspelling te verbeteren en retentie-indices in te voeren om vergelijking van gegevens over verschillende instrumenten en kolommen mogelijk te maken
Tijdens een chromatografierun wordt één of meer keren per seconde een full-scan massaspectrum verzameld. Dit massaspectrum bepaalt de m/z van alle op dat moment aanwezige ionen. Voor HILIC stationaire fasen die worden toegepast voor de analyse van alle soorten monsters en C18 stationaire fasen voor de analyse van urine, wordt routinematig een m/z-bereik van 50 (of 100) tot 1000 toegepast. Voor lipidomisch onderzoek wordt een m/z-bereik van 200-1500 of 2000 gebruikt, waarbij de hogere bovengrens de detectie van triacylglyceriden en cardiolipines met een hoger molecuulgewicht mogelijk maakt. Elke volledige scan levert een massaspectrum met m/z- en intensiteitsgegevens op, die kunnen worden gebruikt om voor elke gedetecteerde metaboliet chromatogrammen met enkelvoudige ionen of chromatogrammen met basispieken met hoge massanauwkeurigheid te tekenen. Single-ionchromatogrammen plotten een enkele m/z met een door de gebruiker gedefinieerd massabereik voor elk gegevenspunt van een chromatogram, terwijl base peak-chromatogrammen de m/z met de hoogste intensiteit voor elk gegevenspunt plotten, waarbij de uitgezette m/z dezelfde kunnen zijn of verschillende m/z-gegevens voor verschillende gegevenspunten kunnen worden uitgezet. Single-ion-chromatogrammen worden uitgezet om piekgebieden te definiëren, die worden toegepast bij de gegevensanalyse in software voor gegevensverwerking. De complexiteit van het elektrospray-ionisatiemassaspectrum waarbij meerdere metabolietkenmerken worden gedetecteerd en dezelfde metaboliet vertegenwoordigen, wordt besproken in punt 8.
Gasfase-fragmentatie van metabolieten wordt toegepast om een MS/MS-massaspectrum te genereren, dat representatief is voor de chemische structuur van de metaboliet, aangezien verschillende chemische structuren verschillende MS/MS-spectra zullen genereren. Het MS/MS-spectrum is afhankelijk van de chemische structuur en kan worden toegepast (idealiter in combinatie met chromatografische scheiding) om verschillende isomeren, die dezelfde m/z hebben, te identificeren. Er kunnen twee verschillende soorten MS/MS-gegevens worden verkregen, namelijk gegevensafhankelijke analyse (DDA) en gegevensonafhankelijke analyse (DIA/SWATH) . DDA is de traditionele aanpak, waarbij een prescan massaspectrum wordt verkregen waaruit een aantal m/z-pieken wordt gekozen die worden geïsoleerd (meestal in een quadrupool) massa-analyzer, gevolgd door fragmentatie in een botsingscel en daaropvolgende massa-analyse om het MS/MS-productionmassaspectrum te verkrijgen. De keuze van één of meer m/z-pieken die in serie worden geïsoleerd en gefragmenteerd, wordt meestal gebaseerd op de intensiteit, waarbij de m/z met de hoogste intensiteit het eerst wordt geïsoleerd en gefragmenteerd. Dit wordt bovenaan de “n”-benadering gedefinieerd, waarbij n het aantal verschillende m/z-pieken is dat tussen elke volledige scanopname wordt gefragmenteerd. Een aantal regels kan computationeel worden toegepast om ervoor te zorgen dat (1) herhaalde verzameling van hetzelfde m/z-isolatievenster niet wordt waargenomen door middel van een herhaalde telling; (2) chemische ruispieken niet worden gefragmenteerd door gebruikmaking van een vooraf gedefinieerde uitsluitingslijst; (3) metabolieten worden gefragmenteerd door gebruikmaking van een insluitingslijst. Een isolatiebreedte wordt door de analist bepaald en bedraagt normaliter ± 1 of 2 Da, zodat één of meer metabolieten kunnen worden geïsoleerd en gefragmenteerd en een samengesteld MS/MS-massaspectrum kan worden gegenereerd. Een isolatiebreedte van > 1,0 Da maakt het mogelijk 13C-isotopenpieken (13C, een stabiele isotoop, is aanwezig bij ongeveer 1,1% in natuurlijke abundantie) op te nemen in het fragmentatieproces en 13C-isotopeninformatie waar te nemen in het MS/MS-massaspectrum. De zuiverheid van het isolatievenster wordt normaliter niet in aanmerking genomen bij het matchen van experimentele MS/MS-spectra met MS/MS-spectra die beschikbaar zijn in massaspectrumbibliotheken en zijn verkregen door analyse van zuivere authentieke chemische standaards. Onlangs is software ontwikkeld om de zuiverheid van MS/MS-massaspectra te berekenen (msPurity) en daaruit is gebleken dat een gemiddelde zuiverheid van 70% of meer routinematig wordt waargenomen in ongerichte metabole fenotyperingsstudies. Hoewel DDA het meest routinematig wordt toegepast, heeft het beperkingen (1) MS/MS-massaspectra voor alle metabolieten worden niet verkregen in analyses die 15 minuten duren; (2) verschillende iontypes (bv. geprotoneerde en gesodificeerde adductionen) van dezelfde metaboliet kunnen beide worden gekozen voor fragmentatie hoewel slechts één iontype vereist is; (3) het type ion dat gefragmenteerd wordt, is niet intelligent gedefinieerd hoewel verschillende iontypes gemakkelijker en informatiever kunnen fragmenteren (bv, een geprotoneerd ion zou geschikter en informatiever zijn dan een gesodificeerd adduction, dat fragmenteert door het verlies van het natriumion en waarbij geen andere significante fragmentatie wordt waargenomen). De botsingsenergie die wordt toegepast om een informatief MS/MS-spectrum te verkrijgen, is ook afhankelijk van de chemische structuur; geen enkele botsingsenergie is geschikt voor alle metabolieten en in plaats daarvan moet een breed scala van botsingsenergieën worden toegepast. Er kunnen verschillende benaderingen worden toegepast om de verkregen informatieve MS/MS-spectra te maximaliseren. De eerste benadering past meerdere botsingsenergieën toe voor fragmentatie van dezelfde metaboliet, gevolgd door de combinatie van meerdere MS/MS-spectra tot één samengesteld MS/MS-massaspectrum, en dit wordt gedefinieerd als getrapte botsingsenergieën. De tweede aanpak past dezelfde botsingsenergie toe voor één monsterinjectie, maar past een verschillende botsingsenergie toe voor verschillende monsterinjecties . Hierdoor kunnen botsingsenergiespecifieke MS/MS-spectra worden verkregen. De belangrijkste beperking van DDA data-acquisitie is echter dat een MS / MS massaspectrum niet wordt verworven voor alle metabolieten in ongerichte studies.
Om de verminderde dekking van metabolieten met MS / MS-data verworven wanneer DDA wordt toegepast te overwinnen, kan een alternatieve aanpak genaamd data-onafhankelijke analyse worden toegepast; dit wordt ook wel aangeduid als SWATH . Zoals de naam al aangeeft, is de MS/MS-gegevensverzameling onafhankelijk van de gegevens en de regels die in DDA worden toegepast. In plaats daarvan worden bredere isolatievensters toegepast (bv. 25 Da) en wordt een MS/MS-massaspectrum verkregen voor alle ionen die in elk isolatievenster aanwezig zijn, in serie over het volledige m/z-bereik. Deze aanpak garandeert dat voor alle metabolieten een MS/MS-massaspectrum wordt verkregen, hoewel het MS/MS-massaspectrum een composiet kan zijn van meerdere metabolieten of chemische ruisionen en derhalve een minder zuiver MS/MS-spectrum wordt geconstrueerd. Resolutie van chromatografische pieken die niet coelueren, kan worden toegepast om het MS/MS-massaspectrum voor elke afzonderlijke metaboliet computationeel af te leiden. Het massaspectrum kan worden gebruikt voor annotatie van metabolieten of voor kwantificering omdat voor alle metabolieten continu MS/MS-gegevens worden verzameld. Om DIA-gegevensacquisitie mogelijk te maken, zijn massaspectrometers met hoge scansnelheden of UPLC met bredere chromatografische pieken vereist om ervoor te zorgen dat een passend aantal full-scan datapunten over een chromatografische piek wordt verzameld, in combinatie met maximaal 40 DIA-vensters die ook worden verworven. DIA-methoden zijn voortgekomen uit de ontwikkeling van SWATH-technologieën door Aebersold, die vervolgens door Sciex op de markt zijn gebracht, eerst voor proteomische toepassingen en meer recentelijk voor metabolomische toepassingen. Andere instrumentenplatforms bieden ook DIA-mogelijkheden. In de proteomica wordt een DIA-bibliotheek, bestaande uit het MS/MS-massaspectrum voor alle mogelijke eiwitten/peptiden, doorgaans gebruikt om de deconvolutie te ondersteunen en de nauwkeurigheid ervan te verhogen door voor elk massaspectrum te zoeken. Dit kan worden uitgevoerd als het volledige proteoom bekend is en de in silico constructie van MS/MS-bibliotheken is uitgevoerd. Voor metabole fenotypering zijn momenteel echter niet alle verwachte metabolieten bekend, is het gebrek aan authentieke chemische standaarden beperkend en zijn in silico benaderingen voor nauwkeurige voorspelling van MS/MS-massaspectra momenteel beperkt. Daarom kan deze aanpak worden toegepast voor een subset van bekende metabolieten met een MS / MS-bibliotheek of een ongerichte DIA aanpak kan worden toegepast met deconvolutie wordt uitgevoerd afhankelijk of onafhankelijk van een MS / MS-bibliotheek (bijv. het toepassen van MS-DIAL ).
Sommige methoden passen een m / z bereik voor de isolatie venster identiek aan de volledige scan m / z bereik leidt tot alle ionen in deze grote isolatie venster wordt gefragmenteerd en de productie van een complexe MS / MS massaspectrum waarvoor computationele deconvolutie. De platforms van Waters kunnen MSE toepassen waarbij afwisselend een lage en een hoge botsingsenergie wordt toegepast om full-scan gegevens en MS/MS-gegevens voor alle ionen op elk tijdstip te verzamelen, en de platforms van Thermo Scientific kunnen All Ion Fragmentation (AIF) toepassen. De chromatografische resolutie van metabolieten en de scansnelheid kunnen van grote invloed zijn op de nauwkeurigheid van de deconvolutiestap en de zuiverheid van MS/MS-massaspectra van afzonderlijke metabolieten.