Are There Naturally Occurring Pleomorphic Bacteria in the Blood of Healthy Humans?

Na nossa busca de espiroquetas envolvidas na doença de Alzheimer (13), observámos bactérias pleomórficas no sangue de indivíduos humanos saudáveis através de microscopia de campo escuro. Esta foi uma descoberta surpreendente, uma vez que é geralmente reconhecido que a corrente sanguínea em seres humanos saudáveis é um ambiente estéril (7) excepto quando há uma quebra na integridade das membranas dos tecidos (6). Contudo, o conceito da ocorrência de bactérias no sangue de seres humanos saudáveis é agora mais plausível devido às abordagens laboratoriais independentes do cultivo. As principais técnicas empregadas em tais estudos incluem a amplificação por PCR e a sequenciação do ADN ribossómico16S (rDNA). Estes métodos revelaram a presença de uma grande diversidade de microrganismos no ambiente, e mesmo no interior do corpo humano (12). Neste relatório apresentamos provas baseadas em técnicas filogenéticas moleculares e microscopia leve e electrónica, bem como outros métodos microbiológicos convencionais, para a existência de uma população de bactérias no sangue humano saudável. Tendo em conta a aparente natureza controversa das nossas descobertas, foi encorajador registar o recente relatório de Nikkari et al. (14), que detectaram sequências de rDNA bacteriano associado ao sangue utilizando métodos de PCR em tempo real e uma sonda que visava regiões conservadas de rDNA 16S bacteriano, e um relatório anterior de Tedeshi et al. (16) sobre a presença de bactérias pleomórficas como parasitas intraerythrocytic em sujeitos humanos clinicamente saudáveis.

Para um exame microscópico leve, foram colhidas amostras de sangue de 25 voluntários saudáveis num tubo Vacutainer sem anticoagulantes (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.); o sangue foi colhido da forma convencional envolvendo a antissepsia da pele e evitando qualquer introdução de microrganismos externos por contaminação. (Uma vez que a contaminação externa era sempre uma possibilidade, foram sempre exercidos cuidados e precauções especiais para evitar isto. Os procedimentos específicos, assim como os controlos adequados, são especificados ao longo do texto). Uma montagem húmida do soro do sangue coagulado de cada amostra, fresco ou incubado a 30°C entre 5 a 7 dias, foi examinada por microscopia de campo escuro (Leitz Dialux 20) para bactérias pleomórficas.

Para amplificação por PCR, foi utilizada uma alíquota de 0,5 ml de sangue incubado contendo bactérias pleomórficas para extracção convencional de ADN pelo método de Higuchi (11). Foram utilizados três microlitros do extracto para amplificação de ADN pelo método de Edwards et al. (8) utilizando o primer forward BSF8/20 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) e o primer reverso BSR1541/20 (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′).Foram realizados trinta ciclos de PCR, com 1 ciclo constituído pelos seguintes passos: (i) desnaturação (1 min a 94°C), (ii) recozimento (30 s a 70°C), e (iii) extensão (90 s a 72°C). A polimerase do ADN ventilado (New England BioLabs, Mississauga, Ontário, Canadá) foi utilizada devido à sua capacidade de revisão.

Amplicões foram resolvidos por electroforese em gel padrão e detectados por coloração com brometo de etídeo. O ADN foi purificado utilizando o kit Geneclean II (Bio 101, Inc., La Jolla, Califórnia.), e o ADN foi clonado no sítio SmaI do vector pBluescript II (Stratagene, La Jolla, Califórnia.). A análise da sequência nucleotídica de dois clones escolhidos aleatoriamente foi realizada utilizando o sequenciador automático de ADN ABI (modelo 373A) e os kits de sequenciação do ciclo ABI Prism com a polimerase AmpliTaq FS (Perkin-Elmer Corp., Boston, Mass.).

O gene gyrB foi amplificado por PCR pelo protocolo delineado por Yamamoto e Harayama (21). Os amplicons foram clonados utilizando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia.).

Os dados de sequência foram analisados utilizando o programa BLASTN do National Center for Biotechnology Information (Bethesda, Md.) (1). As sequências de candidatos com as pontuações mais elevadas foram recuperadas em conformidade e alinhadas utilizando o programa NALIGN de PC/Gene (Intelligenetics, Inc.).

Para realizar a hibridação fluorescente in situ (FISH), o sangue foi retirado sob as condições assépticas idênticas habituais (para evitar contaminação) de três sujeitos saudáveis e incubado durante 6 dias a 30°C em tubos de vidro interior estéril da marca Vacutainer (16 por 100 mm). A amostra de sangue foi diluída 1:10 com uma solução salina tampão fosfato (PBS) complementada com 10 mM de pirofosfato. A amostra foi centrifugada durante 5 s e depois filtrada através de uma seringa de Acrodisco estéril de tamanho 0,8-μm para remover os eritrócitos e os detritos. As alíquotas de um mililitro da amostra foram centrifugadas durante 10 minutos a 14.000 × g. Os procedimentos subsequentes de fixação e hibridação foram feitos pelo protocolo descrito por Thomas et al. (17). Em resumo, as células bacterianas granuladas foram fixadas com 1 ml de 3% (p/vol) de paraformaldeído recentemente preparado a 4°C durante 24 h. As células foram então granuladas durante 10 min a 14.000 × g e permeabilizadas por incubação do sedimento com 1 ml de uma mistura fria de etanol e PBS (1:1, vol/vol) durante 5 min a 25°C. As bactérias foram lavadas com PBS e ressuspendidas em 50 μl de tampão de hibridação (0,9 M NaCl, 20 mM Tris ) que foi pré-aquecido a 50°C e suplementado com 10 ng de sondas fluorescentes por μl. As sondas utilizadas foram todas os oligonucleótidos marcados com rRNA fluorescentes: a sonda eubacteriana (EUB) BSR1541/20 (8); não EUB, que é complementar à sonda bacteriana universal EUB utilizada como controlo negativo para não especificidade (3); e a sonda eucariótica EUK (18). As suspensões foram incubadas durante 24 h a 50°C, e a hibridação foi interrompida por centrifugação das amostras durante 2 min a 8.000 × g, descartando o sobrenadante, e adicionando 1 ml de PBS. O brometo de etídio (0,5 μg/ml) foi adicionado imediatamente antes da análise de citometria de fluxo.

Para microscopia electrónica, as células bacterianas em amostras de sangue incubado de sujeitos saudáveis foram separadas dos elementos sanguíneos pelo seguinte método. Uma diluição de 1:10 de sangue em PBS foi centrifugada numa microcentrifugadora a 14.000 × g durante 5 s. O sobrenadante foi removido e centrifugado como descrito acima durante 10 min. Foi decantado, e o granulado foi lavado duas vezes em PBS. A pastilha contendo uma alta concentração de bactérias do sangue foi ressuspendida num pequeno volume final de PBS. Em alternativa, o sangue diluído 1:10 em PBS foi filtrado através de um filtro de membrana de tamanho 0,45-μm. O filtrado foi centrifugado a 14.000 × g durante 10 min, e o sedimento foi lavado duas vezes com PBS. Esta pastilha também foi ressuspendida num pequeno volume de PBS para microscopia electrónica. A coloração negativa foi realizada com ácido fosfotúngstico a 2%. Para se preparar para a secção de ultrathin, as células foram fixadas em 2,5% de glutaraldeído em tampão de cacodilato 0,1 M durante 2 h. As células foram subsequentemente desidratadas, incorporadas e seccionadas. As secções foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo e examinadas utilizando o microscópio electrónico de transmissão JEOL 2000 FX (TEM).

Promperada pela nossa observação do que parecia ser um micróbio invulgar numa amostra de sangue de um indivíduo saudável, analisámos várias amostras de sangue para a presença de bactérias por amplificação PCR de 16S rDNA utilizando iniciadores universais. Não foi detectado nenhum produto do dia 0 sangue (por coloração com brometo de etídio), mas o produto PCR foi detectável após o sangue ter sido incubado a 30°C durante 5 dias. A inoculação de alíquotas a partir de amostras de sangue do dia 0 ou do dia 5 em caldo de nutrientes não resultou no crescimento de bactérias. Evidentemente, o sinal PCR obtido não resultou de contaminação bacteriana saprófita.

PCR-amplificados fragmentos de ADN com tamanhos de 1,2 e 1,5 kb destas bactérias foram clonados. Dois plasmídeos recombinantes, B16 e T5, foram utilizados para a sequenciação do ADN. As duas sequências eram idênticas, excepto para uma extremidade truncada 5′ em B16. O gene 16S rRNA quase completo de T5 (1,257 bp) mostrou 99.6% de identidade com a sequência de 1,500-bp de Stenotrophomonas maltophilia LMG958T, uma estirpe do tipo Laboratorium voor Microbiologie Gent Culture Collection, Gand, Bélgica. A sequência de T5 determinada em ambas as vertentes mostrou quatro transições e duas transversais em comparação com a sequência de LM958T (número de adesão GenBank X95923). Esta descoberta foi confirmada com uma segunda amostra de outro tema. (A posição filogenética de S. maltophilia tem estado sob investigação intensiva. Originalmente chamada Pseudomonas maltophilia, foi mais tarde chamada Xanthomonas maltophilia. S. maltophilia está agrupada na subclasse gama da Proteobacteria e representa um táxon distinto.)

A amplificação independente de 16S rDNA a partir de amostras de sangue de três sujeitos adicionais foi alcançada por um de nós (M. Sirois) na Universidade de Quebec em Trois-Rivieres no Canadá. A análise da sequência genética de 16S ribosomal a partir das amostras de sangue destes três sujeitos mostrou que o género bacteriano da homologia mais próxima era Pseudomonas. Isto apoiou as nossas descobertas na Universidade McGill, uma vez que Stenotrophomonas, como indicado acima, fazia anteriormente parte do género Pseudomonas.

Além dos resultados de 16S rRNA obtidos na Universidade McGill, também amplificámos o gene gyrB da bactéria a partir de amostras de sangue. O gene gyrB codifica a proteína da subunidade B da DNA gyrase. A amplificação por PCR do gene gyrB é um novo método molecular para detectar e identificar estirpes bacterianas (21). A sequência do fragmento de PCR 475-bp, que obtivemos no nosso laboratório, foi considerada diferente da do gene parcial gyrB (1,252 bp) da estirpe do tipo S. maltophilia ATCC 13637. Assim, o isolado que isolámos do sangue não é idêntico ao de S. maltophilia ATCC 13637, mas é outra estirpe.

FISH das bactérias do sangue também foi realizado (2, 4). Verificámos que os métodos convencionais de FISH de células inteiras utilizando a sonda de oligonucleótido marcada com fluoresceína BSR1541/20 (complementar a uma região no final do rRNA 16S conservado para todas as eubactérias 3′) não eram adequados devido à lise das bactérias frágeis. Para contornar este problema, a suspensão bacteriana do sangue foi estudada por um protocolo FISH e citometria de fluxo laser (LFC) (3, 17). Esta técnica tem o potencial de analisar rapidamente bactérias viáveis mas não cultiváveis.

Figure 1A mostra o perfil de dispersão de luz da suspensão bacteriana registada pelo LFC que reflecte células e possíveis detritos e ruído de fundo. A região (região a) deste perfil é uma região na qual foram registados eventos fluorescentes. Os sinais fluorescentes emitidos por células que hibridizaram com a sonda não específica (não EUB) marcada com fluoresceína (intensidade fluorescente média de 3,9) são mostrados na Fig. 1B. As IFM registadas na região e em amostras de sangue colhidas de três indivíduos diferentes em 2 dias diferentes foram 2,5 a 3,7 vezes mais elevadas com a sonda BSR1541/20 do que as obtidas com a sonda não-EUB (Tabela 1). Os sinais fluorescentes da sonda EUK marcada com fluoresceína (17), específica para uma região 18S rRNA conservada em todas as eucariotas, não foram diferentes dos da sonda não EUB.

Para caracterizar melhor este grupo de bactérias, foram efectuados estudos morfológicos. Amostras de soro das amostras de sangue que foram recolhidas assepticamente de 25 voluntários e depois permitidas para coagular revelaram a presença de bactérias examinadas por microscopia de campo escuro. A figura 2 mostra a morfologia de um grupo de células preparadas a partir de uma amostra de soro.

Além do seu movimento celular, tal como a flexão, a natureza viável destas bactérias pleomórficas foi reforçada pela sua capacidade de aumentar em número modesto no soro aquando da incubação aeróbica de uma amostra de sangue coagulado a 30°C durante 7 dias. O quadro 2 mostra o aumento do número de células de sete amostras de sangue. Os organismos não eram contaminantes bacterianos saprófitos, uma vez que não foi observado crescimento bacteriano quando as alíquotas de soro foram espalhadas em meios de ágar enriquecido. Infelizmente, as tentativas de crescimento das bactérias em vários meios de laboratório enriquecidos, tais como ágar de nutrientes sanguíneos, ágar espiroqueta, ágar micoplasma, e meio de leptospira, não foram bem sucedidas. Concluiu-se que as bactérias pleomórficas no sangue eram viáveis mas não podiam ser cultivadas in vitro por técnicas convencionais. Note-se que as lavagens dos tubos de recolha de sangue não produziram bactérias pleomórficas quando examinadas com o microscópio de campo escuro, indicando que os tubos não eram as fontes destas bactérias.

As bactérias isoladas das amostras de sangue foram selectivamente inibidas pelos antibióticos. A tabela 3 mostra os efeitos de dois antibióticos no crescimento da bactéria em soros. A polimixina B foi a mais inibidora, enquanto que a bacitracina teve efeitos limitados.

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