Clinical Significance of an Alloantibody against the Kell Blood Group Glycoprotein

Tabela 1

A amostra de sangue periférico da sonda foi enviada para o nosso laboratório de referência devido à presença de um aloanticorpo IgG que reagiu (3+) com todas as hemácias do painel no anti-fase de globulina humana em solução de baixa resistência iónica e com hemácias modificadas com papaína. O soro materno não era reactivo quando testado quer com hemácias tratadas com ditiotreitol quer com EDTA/glicina-ácido. O título do anticorpo contra as hemácias compatíveis com ABO do seu marido era de 128. A tipagem eritrócita prolongada foi realizada utilizando a técnica de tubo, e foi identificado o fenótipo seguinte: C+ c+ E- e+; M+ N- S- s+; Fy(a+ b+); Jk(a+ b-); Lu(a- b+); Le(a- b+); K- k-; Kp(a- b-); Js(a- b-). As hemácias do doente deram negativo para todos os antigénios do grupo sanguíneo Kell estudados. O DAT e o autocontrolo foram negativos tanto pelo método de tubo convencional como pelo teste de gel. No conjunto, estes resultados sugeriram um potencial fenótipo K₀ com a presença de um aloanticorpo anti-Ku. Ocasionalmente, é difícil distinguir por serologia entre um K₀ e um fenótipo Kmod. A detecção de antigénios Kell depende muito da avidez dos reagentes utilizados; portanto, por vezes é difícil estabelecer os limites entre uma aglutinação fracamente positiva e uma aglutinação negativa. Considerando isto, a possibilidade de um fenótipo Kmod com um anticorpo anti-Ku não poderia ser desconsiderada até que fossem realizadas investigações moleculares.

genotipagem KEL foi realizada em ADN genómico materno através de estratégias de polimorfismo de restrição de fragmentos de reacção em cadeia da polimerase (PCR) e mostrou os genótipos KEL*02/02, KEL*04/04 e KEL*07/07. Devido à discrepância entre os resultados serológicos e moleculares, cada um dos 19 exões do gene KEL e os limites intron-exon foram sequenciados utilizando o método Sanger dideoxy . Os cromatogramas mostraram uma substituição homozigotos de uma guanina por uma adenina no primeiro nucleótido de Intron 3 (IVS3 + 1g>a) alterando a sequência gt conservada no site 5ʹ splice para at. Este evento causa emendas aberrantes de RNA, alterando o quadro de leitura e introduzindo um códão de paragem prematura que impede a expressão da glicoproteína Kell na membrana RBC . Os dados de sequenciamento fornecidos pelo Exome Aggregation Consortium , obtidos de 60.706 indivíduos não relacionados de diversas etnias, mostraram que o IVS3 + 1g>a mutação (adesão dbSNP: rs369569464) tem uma frequência de 8,29 × 10-5 e foi encontrado em populações europeias (não finlandesas), europeias (finlandesas), latinas e do Sul da Ásia. A variante IVS3 + 1a, denominada alelo KEL*02N.06 pela Sociedade Internacional de Transfusão de Sangue, é uma das bases genéticas mais frequentes para o extremamente raro fenótipo K₀ . A análise molecular confirmou que a probanda tinha o fenótipo K₀, e é altamente sugerido que a especificidade do aloanticorpo encontrado no soro do doente era efectivamente um anti-Ku.

Os membros da família da Proband foram investigados por métodos serológicos e moleculares a fim de lhes proporcionar um aconselhamento adequado em relação à alloimunização após a transfusão e/ou gravidez. Foi desenvolvida uma estratégia de PCR com iniciador específico de sequência (SSP) para detectar a mutação encontrada na probanda. Duas PCRs separadas foram realizadas utilizando um primer forward (ATCTTTCACCTCTTGGTTCCTCCC) complementar a uma sequência consensual do gene KEL emparelhado com primers invertidos contendo no seu 3ʹ termina (posição IVS3 + 1) os nucleótidos polimórficos C (GGGGGGTCTGGGATTGCTTGCTTAC) a recozer com G no alelo tipo KELwild ou T (GGGGGTCTGGGATTGCTTAT) a recozer com A no KEL*02N.06 alelo, em cada reacção. Para estabelecer condições óptimas de PCR, foram utilizadas amostras de ADN do paciente (genótipo KEL*02N.06/KEL*02N.06) e um indivíduo normal (genótipo KEL*01/KEL*02). Foram realizadas amplificações com aproximadamente 0,5 μg de ADN genómico num volume final de 10 μl contendo 0,4 μmol/l de cada primer (excepto os primers utilizados para controlos positivos internos que estavam a 0,04 μmol/l), 0,2 mmol/l de cada dNTP, 2 mmol/l MgCl2 e 1 U de Taq DNA polimerase em tampão apropriado. As PCRs começaram com um ciclo de desnaturação a 94 °C durante 5 min e terminaram com um ciclo de 10 min a 72 °C para completar a extensão. Os parâmetros de ciclo foram 30 ciclos de 40 s a 94 °C, 40 s a 67 °C para o recozimento, e 40 s a 72 °C para a extensão. Em todas as reacções de PCR foi utilizado como controlo positivo interno um par de iniciadores que amplificam uma sequência consensual do gene da hormona de crescimento humano. Os produtos PCR (435 bp para controlo positivo interno e 192 bp para produtos específicos) foram analisados por electroforese em 2% de gel de agarose. Esta estratégia permite a detecção do alelo KEL*02N.06 em dose dupla ou única. Os resultados serológicos e PCR-SSP (fig. 1) demonstraram que sete membros da família (mãe, pai, 2 irmãs, 1 irmão e 2 filhos) expressam antigénios k, Kpb e Jsb e transportam uma dose única do alelo KEL*02N.06.

Discussão

Estudos moleculares realizados na amostra da sonda permitiram a identificação do alelo responsável por um fenótipo K₀ (KEL*02N.06) na homozigosidade e apoiam a conclusão de que a especificidade do aloanticorpo encontrado na mãe era anti-Ku.

Antibodies to antigens no sistema de grupo sanguíneo Kell são normalmente IgG e podem estar envolvidos em reacções transfusionais hemolíticas e HDFN . Algumas especificidades, como anti-K e anti-Kpa, têm sido associadas não só à destruição mediada por IgG de hemácias maduras, mas também à supressão da eritropoiese, promovendo a destruição imunitária de células progenitoras eritróides precoces por macrófagos no fígado fetal. Quanto ao anti-Ku, pouco se sabe sobre o seu significado clínico, devido ao facto de os indivíduos sensibilizados K₀ serem raros. Enquanto alguns autores descreveram o anti-Ku para produzir reacções transfusionais hemolíticas e HDFN, a falta de hemólise atribuída a esta especificidade tem sido observada por outros . No nosso caso, os resultados laboratoriais e o curso clínico do recém-nascido foram consistentes com a destruição de hemácias imunomediadas. A hiperbilirrubinemia encontrada no recém-nascido aumentou progressivamente atingindo um pico no 3º dia de vida enquanto que, concomitantemente, os valores de hematócrito e hemoglobina diminuíram, mostrando uma anemia moderada. Tendo em conta que a mãe e o bebé eram ABO-idênticos, o aumento dos valores de bilirrubina não pode ser atribuído à incompatibilidade ABO, mas sim à acção do aloanticorpo anti-Ku, que por sua vez depende da subclasse IgG envolvida. É bem conhecido que IgG1 e IgG3 interagem eficazmente com a maioria dos receptores Fcγ em células fagocitárias, enquanto IgG2 e IgG4 mostram uma afinidade reduzida com a maioria deles . Consequentemente, a taxa de eliminação de eritrócitos sensibilizados da circulação depende da subclasse IgG do anticorpo ligado à membrana da hemácia. Infelizmente, a determinação da subclasse IgG não pôde ser realizada, no entanto, os resultados clínicos e laboratoriais sugerem que no nosso caso a hiperbilirrubinemia e anemia do recém-nascido foi causada pela destruição imunitária das hemácias devido à IgG1 e/ou IgG3 anti-aloanticorpo IgG3. Para notar, o hematócrito e o nível de hemoglobina ao nascimento eram normais, e a contagem de reticulócitos no dia 3 reflectia a produção de hemácias em resposta à anemia. Estas observações sugerem que o anti-Ku materno não causou um efeito supressor da eritropoiese fetal durante a gravidez, tal como descrito para outras especificidades dentro do sistema de grupo sanguíneo de Kell . Caso contrário, os parâmetros associados à produção de hemácias teriam sido acentuadamente diminuídos no recém-nascido.

O bebé foi brevemente tratado com fototerapia e teve alta em casa no 5º dia em boas condições. A anemia do bebé resolvida após 4 meses sem necessidade de transfusão de sangue, e a hemoglobina permaneceu dentro do intervalo normal. Com 1 ano de idade, a avaliação neurológica do bebé estava normal, não mostrando danos causados pela hiperbilirrubinemia.

Estudámos mais aprofundadamente os membros da família da proband, de modo a proporcionar-lhes aconselhamento adequado relativamente à transfusão e possíveis eventos de aloimunização. Embora a ABO seja compatível com a proband, não foram encontrados indivíduos homozigotos KEL*02N.06 sem expressão antigénica Kell. Estas descobertas mostram que os membros do agregado familiar não são doadores compatíveis em relação ao sistema Kell. Como resultado, os programas de autotransfusão devem ser implementados no paciente em caso de necessidade. Caso contrário, deve ser seguido um protocolo de transfusão de alto risco indicado apenas para situações extremas. Os resultados serológicos e moleculares permitiram-nos informar os familiares da paciente estudada, principalmente as suas duas irmãs, que não estão em risco de desenvolver um anti-Ku.

Em resumo, o nosso caso fornece informações valiosas sobre os resultados serológicos, moleculares e clínicos relativos a HDFN associados a um aloanticorpo anti-Ku produzido por uma mulher grávida K₀. Embora o anticorpo fosse dirigido contra o sistema de grupo sanguíneo Kell, o recém-nascido foi tratado com sucesso com fototerapia, e não foi necessária transfusão de troca. Estudos integrados de fenótipo e genótipo permitiram recomendações médicas precisas para a probanda e o seu grupo familiar.

Aprovação Ética

Foi obtido o consentimento informado escrito dos doentes.

Conhecimento

Estamos gratos a Cecilia Siniscalchi pela sua assistência na análise laboratorial.

Declaração de divulgação

Os autores declaram não ter conflitos de interesse relevantes para o manuscrito submetido.

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