4 Tipos de Dados Adquiridos em Estudos UPLC-MS
plataformas UPLC-MS adquirem três tipos diferentes de dados através da aquisição online em aplicações de rotina (1) tempo de retenção cromatográfica; (2) espectros de massa m/z de varrimento total precisos; e (3) espectros MS/MS. Os dados de mobilidade iónica também podem ser adquiridos em linha. Estes quatro tipos de dados podem ser aplicados para identificar as estruturas químicas dos metabolitos cuja identidade não era conhecida antes da aquisição de dados ou para confirmar a identidade dos metabolitos cuja identidade era conhecida antes da aquisição de dados. A recolha de dados MSn onde n > 2 não é rotineiramente adquirida online e, em vez disso, a recolha de fracções e a infusão de fracções por minutos é aplicada, por exemplo, utilizando um sistema Triversa Nanomate, que permite longos períodos de infusão utilizando baixos volumes de amostra (< 10 μL) .
O sistema UPLC e o espectrómetro de massa geram informação complementar. O tempo de retenção cromatográfico é definido pela “solubilidade” do metabolito nas fases estacionária e móvel e proporciona a separação dos metabolitos numa abordagem complementar aos aplicados no espectrómetro de massa. A previsão in silico dos tempos de retenção, por exemplo com base nos valores log P para aplicações de fase inversa e HILIC, está a ser desenvolvida no seio da comunidade de investigação. São necessárias mais investigações e desenvolvimentos para melhorar a previsão do tempo de retenção em silico e introduzir índices de retenção para permitir a comparação de dados entre diferentes instrumentos e colunas .
Atravessar uma série de cromatografia, é recolhido um espectro de massa de varrimento completo uma ou mais vezes a cada segundo. Este espectro de massa define o m/z de todos os iões presentes nesse momento. Para fases estacionárias HILIC aplicadas à análise de todos os tipos de amostras e fases estacionárias C18 para a análise da urina, é rotineiramente aplicado um intervalo m/z de 50 (ou 100) a 1000. Para estudos lipídicos é aplicado um intervalo m/z de 200-1500 ou 2000, o limite superior mais elevado permite a detecção de triactilicerídeos e cardiolipinas de peso molecular superior. Cada varredura completa produz um espectro de massa com dados m/z e intensidade, que pode ser utilizado para traçar cromatogramas de íon único ou cromatogramas de pico de base com alta precisão de massa para cada metabolito detectado. Os cromatogramas de íon único traçam um único m/z com um intervalo de massa definido pelo utilizador para cada ponto de dados adquirido através de um cromatograma, enquanto que os cromatogramas de pico de base traçam a maior intensidade m/z para cada ponto de dados, os dados m/z traçados podem ser os mesmos ou diferentes dados m/z podem ser traçados para diferentes pontos de dados. Os cromatogramas de um íon são traçados para definir áreas de pico, que são aplicadas na análise de dados no software de processamento de dados. A complexidade do espectro de massa de ionização por electrospray onde são detectadas múltiplas características de metabolitos e representam o mesmo metabolito será discutida na Secção 8.
A fragmentação dos metabolitos por fases de gás é aplicada para gerar um espectro de massa MS/MS, que é representativo da estrutura química do metabolito, uma vez que diferentes estruturas químicas irão gerar diferentes espectros de MS/MS. O espectro de MS/MS é dependente da estrutura química e pode ser aplicado (idealmente em combinação com separação cromatográfica) para identificar diferentes isómeros, que têm o mesmo m/z. Podem ser adquiridos dois tipos diferentes de dados EM/EM, análise dependente de dados (DDA) e análise independente de dados (DIA/SWATH) . A DDA é a abordagem tradicional a aplicar, que adquire um espectro de massa pré-determinado a partir do qual um número de picos m/z são escolhidos para serem isolados (tipicamente num quadrupolo) analisador de massa seguido de fragmentação numa célula de colisão e subsequente análise de massa para adquirir o espectro de massa iónica do produto MS/MS. A escolha de um único ou múltiplos picos m/z a isolar e fragmentar em série é tipicamente baseada na intensidade, sendo o m/z de maior intensidade isolado e fragmentado primeiro. Isto é definido na abordagem “n” superior onde n é o número de diferentes picos m/z fragmentados entre cada aquisição de varrimento completo. Uma série de regras podem ser aplicadas computacionalmente para assegurar (1) a recolha repetitiva da mesma janela de isolamento m/z não é observada através de uma contagem repetida; (2) os picos de ruído químico não são fragmentados através da utilização de uma lista de exclusão predefinida; (3) os metabolitos são fragmentados através da utilização de uma lista de inclusão. Uma largura de isolamento é definida pelo analista e é tipicamente ± 1 ou 2 Da, pelo que um único ou vários metabolitos podem ser isolados e fragmentados e um espectro de massa composto MS/MS gerado. Uma largura de isolamento de > 1,0 Da permite que picos isotópicos 13C (13C, um isótopo estável, está presente a cerca de 1,1% em abundância natural) sejam incluídos no processo de fragmentação e que a informação isotópica 13C seja observada no espectro de massa MS/MS. A pureza da janela de isolamento não é normalmente incluída na correspondência de espectros experimentais de EM/EM com espectros de EM/EM disponíveis em bibliotecas de espectros de massa e adquiridos através da análise de padrões químicos autênticos puros. Software para calcular a pureza dos espectros de massa MS/MS (msPurity) foi recentemente desenvolvido e demonstrou que uma pureza média de 70% ou superior é rotineiramente observada em estudos de fenotipagem metabólica não direccionados. Embora a DDA seja a mais rotineiramente aplicada, tem limitações (1) os espectros de massa de EM/EM para todos os metabolitos não são adquiridos em análises de 15 minutos de comprimento; (2) diferentes tipos de iões (por exemplo, iões protonados e sodiated adduct ions) do mesmo metabolito podem ambos ser escolhidos para fragmentação mesmo que apenas seja necessário um tipo de ião; (3) o tipo de ião fragmentado não é inteligentemente definido embora diferentes tipos de iões possam fragmentar-se mais facilmente e de forma mais informativa (por exemplo um ião protonado seria mais apropriado e informativo do que um ião de adubo sodiatizado, que se fragmenta através da perda do ião sódio sem que se observe qualquer outra fragmentação significativa). A energia de colisão aplicada para adquirir um espectro informativo MS/MS também depende da estrutura química, não é adequada uma única energia de colisão para todos os metabolitos e, em vez disso, deve ser aplicada uma vasta gama de energias de colisão. Podem ser aplicadas diferentes abordagens para maximizar os espectros informativos de EM/EM adquiridos. A primeira abordagem aplica múltiplas energias de colisão para fragmentação do mesmo metabolito, seguida da combinação de múltiplos espectros de EM/EM num único espectro de massa composto de EM/EM, e isto é definido como energias de colisão escalonadas . A segunda abordagem aplica a mesma energia de colisão para uma única injecção de amostra, mas aplica uma energia de colisão diferente para diferentes injecções de amostra . Isto permite a aquisição de espectros de MS/MS específicos da energia de colisão. Contudo, a maior limitação da aquisição de dados DDA é que um espectro de massa MS/MS não é adquirido para todos os metabolitos em estudos não direccionados .
Para superar a cobertura reduzida de metabolitos com dados MS/MS adquiridos quando se aplica DDA, pode ser aplicada uma abordagem alternativa chamada análise independente de dados; isto também é referido como SWATH . Como o nome indica, a aquisição de dados MS/MS é independente dos dados e de quaisquer regras aplicadas na DDA. Em vez disso, são aplicadas janelas de isolamento mais amplas (por exemplo, 25 Da) e é adquirido um espectro de massa MS/MS para todos os iões presentes em cada janela de isolamento em série em toda a gama m/z. Esta abordagem assegura que um espectro de massa MS/MS é adquirido para todos os metabolitos, embora o espectro de massa MS/MS possa ser um composto de múltiplos metabolitos ou iões de ruído químico e, por conseguinte, é construído um espectro de MS/MS de menor pureza. A resolução dos picos cromatográficos que não são coelutantes pode ser aplicada para derivar computacionalmente o espectro de massa de EM/EM para cada metabolito separado. O espectro de massa pode ser aplicado para a anotação de metabolitos ou para a quantificação, porque os dados de EM/EM são continuamente recolhidos para todos os metabolitos. Para permitir a aquisição de dados DIA, são necessários espectrómetros de massa com velocidades de varrimento rápidas ou UPLC com picos cromatográficos mais amplos para assegurar que um número adequado de pontos de dados de varrimento completo são recolhidos através de um pico cromatográfico em combinação com um máximo de 40 janelas DIA também a serem adquiridas. Os métodos DIA surgiram do desenvolvimento das tecnologias SWATH pela Aebersold e que foram subsequentemente comercializados pela Sciex, primeiro para aplicações proteómicas e mais recentemente para aplicações metabólicas . Outras plataformas de instrumentos também fornecem capacidades de DIA. Em proteómica, uma biblioteca DIA composta pelo espectro de massa MS/MS para todas as proteínas/peptídeos possíveis é tipicamente aplicada para ajudar e aumentar a precisão da etapa de desconvolução através da pesquisa de cada espectro de massa . Isto pode ser executado uma vez que o proteoma completo é conhecido e a construção em silico de bibliotecas de MS/MS foi executada. No entanto, para a fenotipagem metabólica, todos os metabolitos esperados não são actualmente conhecidos, a falta de padrões químicos autênticos é limitante e em silico as abordagens para a previsão precisa dos espectros de massa de EM/EM são actualmente limitadas. Portanto, esta abordagem pode ser aplicada para um subconjunto de metabolitos conhecidos com uma biblioteca de MS/MS ou uma abordagem DIA não direccionada pode ser aplicada com a deconvolução a ser executada dependente ou independente de uma biblioteca de MS/MS (por exemplo, aplicando MS-DIAL ).
Alguns métodos aplicam um intervalo m/z para a janela de isolamento idêntico ao intervalo m/z de varrimento total, levando a que todos os iões nesta grande janela de isolamento sejam fragmentados e a produção de um espectro de massa complexo de MS/MS que requer uma deconvolução computacional. As plataformas de águas podem aplicar MSE onde uma energia de colisão baixa e alta são alternativamente aplicadas para recolher dados de varrimento completo e dados de MS/MS para todos os iões em cada ponto de tempo e as plataformas Thermo Scientific podem aplicar toda a fragmentação de iões (AIF) . A resolução cromatográfica dos metabolitos e a velocidade de varredura podem ter um impacto significativo na precisão da etapa de desconvolução e pureza dos espectros de massa de MS/MS de metabolito único.