Mentre serviva nell’esercito, divenne un tiratore scelto. Il capitano convinse Fleming a perseguire una carriera nella ricerca invece che nella chirurgia, in modo da poter rimanere alla scuola. Fleming fu preso sotto l’ala di Sir Almroth Wright, un pioniere dell’immunologia e della ricerca sui vaccini. Fleming rimase con questo gruppo di ricerca per tutta la sua carriera.
Come capitano del Corpo Medico dell’Esercito nella prima guerra mondiale, fu testimone della morte di molti dei suoi compagni a causa di infezioni incontrollate. All’epoca si usavano antisettici che spesso causavano più danni che benefici. Fleming scrisse un articolo in cui discuteva dei batteri anaerobi presenti nelle ferite profonde, che non venivano distrutti dagli antisettici. La sua ricerca non fu inizialmente accettata, ma lui continuò.
Nel 1922, Fleming scoprì il lisozima, un enzima con deboli proprietà antibatteriche che inibiva la crescita batterica. Trovò anche il lisozima nelle unghie, nei capelli, nella saliva, nella pelle e nelle lacrime. Nella sua ricerca, Fleming scoprì che il lisozima era efficace solo contro un piccolo numero di batteri non nocivi.
Nel 1928, iniziò a ricercare i comuni batteri stafilococchi. Una capsula di Petri scoperta vicino a una finestra aperta si contaminò con la muffa. Fleming si rese conto che i batteri vicino alla muffa stavano morendo. Ha isolato la muffa e l’ha identificata come genere Penicillium, che ha scoperto essere efficace contro tutti gli agenti patogeni Gram-positivi. Gli agenti patogeni Gram-positivi causano malattie come la difterite, la gonorrea, la meningite, la polmonite e la scarlattina. Fleming scoprì che non era la muffa stessa ma un “succo” che aveva prodotto a distruggere i batteri. Chiamò questo “succo di muffa” penicillina.
In seguito, Fleming disse: “Quando mi svegliai poco dopo l’alba del 28 settembre 1928, non avevo certo intenzione di rivoluzionare tutta la medicina scoprendo il primo antibiotico, o killer di batteri, del mondo. Ma suppongo che era esattamente quello che ho fatto.”
Inizialmente, la comunità medica non era così entusiasta della scoperta della penicillina di Fleming. Aveva anche difficoltà a isolare grandi quantità di “succo di muffa”. Nel 1940, proprio quando Fleming stava per andare in pensione, 2 colleghi scienziati, Ernst Chain e Howard Florey, si interessarono alla penicillina. Presto, furono in grado di produrre in massa la penicillina per l’uso durante la seconda guerra mondiale.
Fleming ricevette molti riconoscimenti, tra cui 30 lauree honoris causa, e soprattutto il premio Nobel in fisiologia/medicina nel 1945. È stato anche nominato una delle persone più importanti del 20° secolo da Time Magazine.
In termini di vita personale, Fleming era conosciuto come modesto, paziente, tranquillo, timido e poco emotivo. Evitava l’attenzione e a volte era persino dolorosamente silenzioso con gli amici più stretti e persino con sua moglie, Sarah Marion McElroy, un’infermiera. Fleming e sua moglie ebbero un figlio, Robert, che divenne un medico generico. Quando lei morì dopo 34 anni di matrimonio, Fleming ebbe un periodo molto difficile. Si perse nel suo lavoro, passando la maggior parte del suo tempo dietro le porte chiuse del laboratorio. Nel 1953, Fleming sposò la dottoressa Amalia Koutsouri-Vourekas in una chiesa greca di Londra.
Morì a casa, di trombosi coronarica, nel 1955, dopo aver sofferto di disturbi allo stomaco per settimane.
Si disse che Fleming “morì come desiderava: tranquillamente, senza un graduale declino della capacità fisica o mentale, e persino senza scomodare il suo medico.”