Processing of Clinical Specimens
Quando si raccolgono campioni da pazienti per l’isolamento e l’identificazione di batteri anaerobi associati a infezioni, si devono prendere precauzioni per escludere l’aria (Fig. 17-3). Il materiale per la coltura anaerobica si ottiene meglio con un ago e una siringa. A meno che il campione non possa essere inviato immediatamente al laboratorio, esso viene posto in un tubo di trasporto anaerobico contenente anidride carbonica o azoto senza ossigeno. Il campione viene iniettato attraverso il tappo di gomma nella provetta di trasporto e rimane nell’ambiente anaerobico della provetta fino a quando non viene processato nel laboratorio di batteriologia. Se il campione viene raccolto con un tampone, viene utilizzato solo uno speciale sistema di trasporto anaerobico disponibile in commercio.
Figura 17-3
Isolamento e identificazione degli anaerobi.
I campioni devono essere privi di batteri contaminanti. Il materiale proveniente da siti che sono normalmente sterili, come il sangue, il liquido spinale o il liquido pleurico, non pone problemi, a condizione che vengano prese le solite precauzioni per decontaminare adeguatamente la pelle prima di forarla per ottenere il campione. Campioni fecali, campioni di espettorato o secrezioni vaginali non possono essere messi in coltura di routine per gli anaerobi patogeni perché normalmente contengono altri organismi anaerobi. Gli aspirati da ascessi o dai siti specifici delle infezioni devono essere ottenuti in questi casi per evitare una contaminazione indebita con i componenti della flora indigena.
Anche se sono disponibili diverse tecniche per mantenere un ambiente privo di ossigeno durante il trattamento dei campioni per la coltura anaerobica, la giara anaerobica è la più comune. Si tratta di un barattolo di vetro o di plastica di medie dimensioni con un coperchio ben aderente che contiene particelle di allumina rivestite di palladio, che servono da catalizzatore. Può essere allestito con due metodi. Il più semplice utilizza una busta generatrice di idrogeno e anidride carbonica disponibile in commercio (GasPak) che viene posta nel barattolo insieme alle piastre di coltura. Il generatore è attivato con acqua. L’ossigeno all’interno della giara e l’idrogeno generato sono convertiti in acqua in presenza del catalizzatore, producendo così condizioni anaerobiche. L’anidride carbonica, che viene anche generata, è necessaria per la crescita di alcuni anaerobi e stimola la crescita di altri. Un metodo alternativo per ottenere l’anaerobiosi nella giara consiste nell’evacuazione e sostituzione. L’aria viene evacuata dalla giara sigillata che contiene le piastre di coltura e viene sostituita con una miscela priva di ossigeno dell’80% di azoto, 10% di idrogeno e 10% di anidride carbonica.
Per isolare i microrganismi estremamente sensibili all’ossigeno che non possono essere recuperati usando la giara anaerobica si usano procedure più sofisticate. Uno di questi, il metodo della provetta a rotolo, consiste in una provetta tappata che contiene gas privo di ossigeno e un sottile strato di terreno di agar precotto sulla sua superficie interna. Il mezzo nella provetta viene inoculato con un’ansa mentre la provetta viene ruotata. Questo produce una traccia a spirale sulla superficie dell’agar. Il tubo viene lavato con un flusso di anidride carbonica per prevenire l’ingresso di aria mentre è aperto durante l’inoculazione.
L’isolatore anaerobico glove box è un’altra innovazione sviluppata per isolare i batteri anaerobici. È essenzialmente una grande camera in vinile chiaro, con guanti attaccati, contenente una miscela di 80 per cento di azoto, 10 per cento di idrogeno e 10 per cento di anidride carbonica. Una serratura a un’estremità della camera è dotata di due botole, una che porta all’esterno e l’altra all’interno della camera. I campioni vengono messi nella serratura, il portello esterno viene chiuso, e l’aria nella serratura viene evacuata e sostituita con la miscela di gas. Il portello interno viene quindi aperto per introdurre il campione nella camera. Le procedure batteriologiche convenzionali sono impiegate per elaborare il campione nell’atmosfera priva di ossigeno.
Anche se questi sistemi complessi sono necessari per isolare i componenti della flora anaerobica, gli studi hanno dimostrato che il vaso anaerobico è adeguato per recuperare anaerobi clinicamente significativi. I batteri estremamente sensibili all’ossigeno della microflora apparentemente non sono associati a processi infettivi.
Le procedure per la coltivazione e l’identificazione dei batteri anaerobi sono ben stabilite (Fig. 17-3). Una varietà di mezzi selettivi e non selettivi è disponibile per la coltivazione degli anaerobi. Un terreno affidabile e non selettivo è costituito da agar Brucella integrato con sangue di pecora, emina, cisteina, carbonato di sodio e menadione. Per identificare gli anaerobi si usano le solite procedure batteriologiche. Queste si basano su reazioni di colorazione Gram, morfologia cellulare e delle colonie, modelli di sensibilità agli antibiotici, reazioni di fermentazione dei carboidrati e altri test biochimici. L’analisi dei prodotti finali del metabolismo, in particolare degli acidi organici, fornisce ulteriori informazioni utili per classificare questi organismi.