Clinical Significance of an Alloantibody against the Kell Blood Group Glycoprotein

Summary

Background: Gli individui Kell null (K0) possono produrre anti-Ku, un anticorpo contro molti epitopi della glicoproteina Kell, dopo la trasfusione e/o la gravidanza. Poiché i pazienti K0 sensibilizzati sono rari, poco si sa sulla rilevanza clinica dell’anti-Ku e in particolare sulla sua associazione alla malattia emolitica del feto e del neonato. Case Report: Questo lavoro descrive un caso di iperbilirubinemia neonatale dovuta alla distruzione eritrocitaria immunomediata da un alloanticorpo diretto contro la glicoproteina Kell. I metodi sierologici e molecolari hanno identificato un alloanticorpo anti-Ku nel siero materno. Un omozigote IVS3 + 1g>una mutazione puntiforme (allele KEL*02N.06) è stato trovato responsabile della mancanza di espressione dell’antigene Kell nei globuli rossi della madre e della successiva alloimmunizzazione dopo una precedente gravidanza. Anche se nella maggior parte dei casi gli anticorpi Kell sono clinicamente gravi e possono causare la soppressione dell’eritropoiesi, nel nostro caso il neonato aveva un’anemia moderata e un’iperbilirubinemia che è stata trattata con successo con la fototerapia senza richiedere una trasfusione di scambio. Gli studi sierologici e molecolari eseguiti nei membri della famiglia della probanda ci hanno permesso di fornire loro una consulenza adeguata per quanto riguarda l’alloimmunizzazione dopo la trasfusione e/o la gravidanza. Conclusioni: Questo caso amplia la comprensione del significato clinico degli alloanticorpi contro gli antigeni del gruppo sanguigno Kell.

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Introduzione

Il sistema Kell (ISBT 006) è uno dei gruppi sanguigni più importanti nella medicina trasfusionale e ostetrica. È altamente immunogenico e gli anticorpi Kell sono considerati clinicamente significativi. Il sistema del gruppo sanguigno Kell comprende 35 antigeni, di cui K/k (KEL1/KEL2), Kpa/Kpb (KEL3/KEL4), e Jsa/Jsb (KEL6/KEL7) sono i più importanti. L’espressione degli antigeni Kell è determinata da diversi alleli del gene KEL che è organizzato in 19 esoni. I polimorfismi a singolo nucleotide sono la causa più comune di diversi fenotipi Kell. Gli antigeni Kell sono espressi sulla glicoproteina Kell di tipo II che attraversa la membrana dei globuli rossi (RBC) una volta ed è collegata attraverso un singolo legame disolfuro alla proteina XK, un polipeptide integrale di membrana che esprime l’antigene del gruppo sanguigno Kx (XK1). L’assenza della proteina XK porta alla sindrome di Mc Leod che è caratterizzata da anomalie neuromuscolari, lieve emolisi e acantocitosi dei globuli rossi con una quantità molto ridotta della proteina Kell e di tutti i suoi antigeni (fenotipo Mc Leod).

I cambiamenti nucleotidici che avvengono nel gene KEL possono dare origine ad alleli silenziosi (alleli K0) responsabili della mancanza di espressione dell’antigene Kell, il cosiddetto fenotipo Kell nullo (fenotipo K₀). Attualmente, sono stati riconosciuti almeno 37 diversi alleli K0 in uno scarso numero di individui che aboliscono l’espressione dell’antigene Kell quando sono portati in omozigosi o eterozigosi composta. Inoltre, diversi cambiamenti nucleotidici che interessano il gene KEL portano ad antigeni Kell depressi o deboli, il che è definito fenotipo Kmod.

La mancanza di glicoproteina Kell negli individui K₀ non risulta in una malattia riconoscibile; tuttavia, essi possono produrre anti-Ku (anti-KEL5), un anticorpo contro molti epitopi nell’intero polipeptide, dopo trasfusione e/o gravidanza. Poiché i pazienti K₀ sensibilizzati sono rari, si sa poco sulla rilevanza clinica dell’anti-Ku e in particolare sulla sua associazione alla malattia emolitica del feto e del neonato (HDFN). Mentre alcuni autori hanno trovato l’anti-Ku associato ad una grave anemia perinatale, altri non hanno trovato alcuna evidenza clinica di neonati affetti. D’altra parte, l’anticorpo anti-Ku-like è stato descritto in individui i cui RBC sono classificati come Kmod. Nel seguente case report, descriviamo la rilevanza clinica di un anti-Ku trovato in una puerpera K₀.

Case Report

Una donna di 21 anni, gravida 2, para 1, argentina, gruppo sanguigno A RhD-positivo è stata ammessa in ospedale in travaglio, a 40 settimane di una gestazione non monitorata. La donna non ha fatto riferimento a precedenti aborti né trasfusioni e ha partorito un bambino di gruppo A RhD-positivo, che pesava 3,320 kg, aveva una marcata iperbilirubinemia (bilirubina totale 6,32 mg/dl) e un test antiglobulina diretto (DAT) positivo (4+). Il neonato è stato immediatamente trattato con fototerapia. I valori di bilirubina totale sono aumentati progressivamente. Non sono stati trovati RBC compatibili con il siero materno per la trasfusione di scambio. Le RBC materne lavate sono state preparate ma non utilizzate perché la bilirubina totale ha cominciato a diminuire gradualmente il giorno 3. La tabella 1 riassume l’evoluzione e i risultati di laboratorio del neonato durante l’ospedalizzazione.

Un campione di sangue periferico del probando è stato inviato al nostro laboratorio di riferimento a causa della presenza di un alloanticorpo IgG RBC che ha reagito (3+) con tutti i RBC del pannello nella fase antiglobulina umana in soluzione a bassa forza ionica e con RBC modificati con papaina. Il siero materno non era reattivo quando testato con RBC trattati con ditiotreitolo o con EDTA/glicina. Il titolo dell’anticorpo contro i RBC ABO-compatibili del marito era 128. La tipizzazione eritrocitaria estesa è stata eseguita utilizzando la tecnica della provetta, ed è stato identificato il seguente fenotipo: C+ c+ E- e+; M+ N- S- s+; Fy(a+ b+); Jk(a+ b-); Lu(a- b+); Le(a- b+); K- k-; Kp(a- b-); Js(a- b-). Gli RBC del paziente sono risultati negativi per tutti gli antigeni del gruppo sanguigno Kell studiati. DAT e autocontrollo erano negativi sia con il metodo convenzionale della provetta che con il test del gel. Complessivamente questi risultati hanno suggerito un potenziale fenotipo K₀ con la presenza di un alloanticorpo anti-Ku. Occasionalmente, è difficile distinguere con la sierologia tra un fenotipo K₀ e un Kmod. La rilevazione degli antigeni Kell dipende fortemente dall’avidità dei reagenti utilizzati; pertanto, a volte è difficile stabilire i confini tra un’agglutinazione debolmente positiva e una negativa. Considerando questo, la possibilità di un fenotipo Kmod con un anticorpo anti-Ku like non poteva essere trascurata fino a quando non sono state effettuate indagini molecolari.

La genotipizzazione KEL è stata eseguita nel DNA genomico materno mediante strategie di polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione della reazione a catena della polimerasi (PCR) e ha mostrato i genotipi KEL*02/02, KEL*04/04 e KEL*07/07. A causa della discrepanza tra i risultati sierologici e molecolari, ciascuno dei 19 esoni del gene KEL e i confini introne-esone sono stati sequenziati utilizzando il metodo Sanger dideoxy. I cromatogrammi hanno mostrato una sostituzione omozigote di una guanina a un’adenina al primo nucleotide dell’introne 3 (IVS3 + 1g>a) cambiando la sequenza conservata gt al sito di splice 5ʹ in at. Questo evento causa lo splicing aberrante dell’RNA, alterando la struttura di lettura e introducendo un codone di stop prematuro che impedisce l’espressione della glicoproteina Kell sulla membrana RBC. I dati di sequenziamento forniti dall’Exome Aggregation Consortium, ottenuti da 60.706 individui non imparentati di diversa etnia, hanno mostrato che la mutazione IVS3 + 1g>a (adesione dbSNP: rs369569464) ha una frequenza di 8,29 × 10-5 ed è stata trovata in popolazioni europee (non finlandesi), europee (finlandesi), latine e sud asiatiche. La variante IVS3 + 1a, denominata allele KEL*02N.06 dalla International Society of Blood Transfusion, è una delle basi genetiche più frequenti per il fenotipo estremamente raro K₀. L’analisi molecolare ha confermato che il probando aveva il fenotipo K₀, ed è altamente suggerito che la specificità dell’alloanticorpo trovato nel siero del paziente era effettivamente un anti-Ku.

I membri della famiglia di Proband sono stati studiati con metodi sierologici e molecolari al fine di fornire loro una consulenza adeguata per quanto riguarda l’alloimmunizzazione dopo la trasfusione e/o la gravidanza. Una strategia PCR con primer sequenza-specifici (SSP) è stata sviluppata per rilevare la mutazione trovata nel probando. Sono state eseguite due PCR separate utilizzando un primer forward (ATCTTTCACCTCTTGGTTCCTCCC) complementare a una sequenza di consenso del gene KEL accoppiato a primer reverse contenenti alle loro 3ʹ estremità (posizione IVS3 + 1) i nucleotidi polimorfici C (GGGGGTCTGGGATCTTGCTTAC) per annebbiarsi con G nell’allele KELwild type o T (GGGGGTCTGGGATCTTGCTTAT) per annebbiarsi con A nel KEL*02N.06 in ogni reazione. Per stabilire le condizioni ottimali di PCR, sono stati utilizzati campioni di DNA del paziente (genotipo KEL*02N.06/KEL*02N.06) e di un individuo normale (genotipo KEL*01/KEL*02). Le amplificazioni sono state eseguite con circa 0,5 μg di DNA genomico in un volume finale di 10 μl contenente 0,4 μmol/l di ogni primer (tranne i primer usati per i controlli positivi interni che erano a 0,04 μmol/l), 0,2 mmol/l di ogni dNTP, 2 mmol/l MgCl2 e 1 U di Taq DNA polimerasi in un buffer appropriato. Le PCR sono iniziate con un ciclo di denaturazione a 94 °C per 5 minuti e sono state terminate con un ciclo di 10 minuti a 72 °C per completare l’estensione. I parametri del ciclo erano 30 cicli di 40 s a 94 °C, 40 s a 67 °C per l’annealing e 40 s a 72 °C per l’estensione. In tutte le reazioni di PCR una coppia di primer che amplifica una sequenza di consenso del gene dell’ormone della crescita umano è stata usata come controllo positivo interno. I prodotti di PCR (435 bp per il controllo positivo interno e 192 bp per i prodotti specifici) sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2%. Questa strategia permette di rilevare l’allele KEL*02N.06 in dose doppia o singola. I risultati sierologici e PCR-SSP (fig. 1) hanno dimostrato che sette membri della famiglia (madre, padre, 2 sorelle, 1 fratello e 2 figli) esprimono gli antigeni K, Kpb e Jsb e sono portatori di una singola dose dell’allele KEL*02N.06.

Discussione

Gli studi molecolari effettuati nel campione del probando hanno permesso di identificare l’allele responsabile di un fenotipo K₀ (KEL*02N.06) in omozigosi e supportano la conclusione che la specificità dell’alloanticorpo riscontrato nella madre fosse anti-Ku.

Gli anticorpi contro gli antigeni del sistema dei gruppi sanguigni Kell sono generalmente IgG e possono essere coinvolti nelle reazioni trasfusionali emolitiche e nella HDFN . Alcune specificità, come l’anti-K e l’anti-Kpa, sono state associate non solo alla distruzione IgG-mediata delle RBC mature, ma anche alla soppressione dell’eritropoiesi promuovendo la distruzione immunitaria delle cellule progenitrici precoci eritroidi da parte dei macrofagi nel fegato fetale. Per quanto riguarda l’anti-Ku, poco si sa sul suo significato clinico a causa del fatto che gli individui K₀ sensibilizzati sono rari. Mentre alcuni autori hanno descritto l’anti-Ku per produrre reazioni trasfusionali emolitiche e HDFN, la mancanza di emolisi attribuita a questa specificità è stata osservata da altri. Nel nostro caso, i risultati di laboratorio e il decorso clinico del neonato erano coerenti con la distruzione RBC immunomediata. L’iperbilirubinemia riscontrata nel neonato è aumentata progressivamente raggiungendo un picco il 3° giorno di vita mentre, in concomitanza, i valori di ematocrito ed emoglobina sono diminuiti, mostrando una moderata anemia. Tenendo conto che madre e bambino erano ABO-identici, l’aumento dei valori di bilirubina non può essere attribuito all’incompatibilità ABO ma all’azione dell’alloanticorpo anti-Ku, che a sua volta dipende dalla sottoclasse IgG coinvolta. È noto che le IgG1 e le IgG3 interagiscono efficacemente con la maggior parte dei recettori Fcγ delle cellule fagocitarie, mentre le IgG2 e le IgG4 mostrano una ridotta affinità con la maggior parte di essi. Di conseguenza, il tasso di clearance degli eritrociti sensibilizzati dalla circolazione dipende dalla sottoclasse IgG dell’anticorpo legato alla membrana RBC. Sfortunatamente, la determinazione della sottoclasse IgG non ha potuto essere eseguita, tuttavia, i risultati clinici e di laboratorio suggeriscono che nel nostro caso l’iperbilirubinemia e l’anemia del neonato erano causate dalla distruzione immunitaria dei RBC dovuta all’alloanticorpo IgG1 e/o IgG3 anti-Ku. Da notare che l’ematocrito e il livello di emoglobina alla nascita erano normali, e la conta dei reticolociti al terzo giorno rifletteva la produzione di RBC in risposta all’anemia. Queste osservazioni suggeriscono che l’anti-Ku materno non ha causato un effetto soppressivo dell’eritropoiesi fetale durante la gravidanza, come descritto per altre specificità nel sistema del gruppo sanguigno Kell. Altrimenti, i parametri associati alla produzione di RBC sarebbero stati marcatamente diminuiti nel neonato.

Il bambino è stato brevemente trattato con fototerapia e dimesso a casa il giorno 5 in buone condizioni. L’anemia del bambino si è risolta dopo 4 mesi senza richiedere una trasfusione di sangue, e l’emoglobina è rimasta nella norma. A 1 anno di età, la valutazione neurologica del bambino era normale, non mostrando alcun danno causato da iperbilirubinemia.

Abbiamo ulteriormente studiato i membri della famiglia del probando in modo da fornire loro una consulenza adeguata per quanto riguarda la trasfusione e possibili eventi di alloimmunizzazione. Anche se ABO-compatibile con il probando, nessun individuo omozigote KEL*02N.06 privo di espressione dell’antigene Kell è stato trovato. Questi risultati mostrano che i membri della famiglia non sono donatori compatibili per quanto riguarda il sistema Kell. Di conseguenza, i programmi di autotrasfusione dovrebbero essere implementati nel paziente in caso di necessità. Altrimenti, deve essere seguito un protocollo di trasfusione ad alto rischio indicato solo per situazioni estreme. I risultati sierologici e molecolari ci hanno permesso di informare i membri della famiglia della paziente studiati, principalmente le sue due sorelle, che non sono a rischio di sviluppare un anti-Ku.

In sintesi, il nostro caso fornisce informazioni preziose sui risultati sierologici, molecolari e clinici riguardanti la HDFN associata a un alloanticorpo anti-Ku prodotto da una donna incinta K₀. Anche se l’anticorpo era diretto contro il sistema del gruppo sanguigno Kell, il neonato è stato trattato con successo con la fototerapia e non è stata necessaria alcuna trasfusione di scambio. Gli studi integrati del fenotipo e del genotipo hanno permesso raccomandazioni mediche precise per la probanda e il suo gruppo familiare.

Approvazione etica

È stato ottenuto il consenso informato scritto dei pazienti.

Riconoscimenti

Siamo grati a Cecilia Siniscalchi per la sua assistenza nelle analisi di laboratorio.

Dichiarazione di divulgazione

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse rilevanti per il manoscritto presentato.

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