4 tipi di dati acquisiti negli studi UPLC-MS
Le piattaforme UPLC-MS acquisiscono tre diversi tipi di dati attraverso l’acquisizione online nelle applicazioni di routine (1) tempo di ritenzione cromatografica; (2) spettri di massa m/z accurati a scansione completa; e (3) spettri MS/MS. Anche i dati di mobilità ionica possono essere acquisiti online. Questi quattro tipi di dati possono essere applicati per identificare le strutture chimiche dei metaboliti la cui identità non era nota prima dell’acquisizione dei dati o per confermare l’identità dei metaboliti la cui identità era nota prima dell’acquisizione dei dati. La raccolta di dati MSn in cui n > 2 non viene abitualmente acquisita online e viene invece applicata la raccolta e l’infusione di frazioni per minuti, ad esempio utilizzando un sistema Triversa Nanomate, che consente lunghi periodi di infusione utilizzando bassi volumi di campione (< 10 μL) .
Il sistema UPLC e lo spettrometro di massa generano informazioni complementari. Il tempo di ritenzione cromatografica è definito dalla “solubilità” del metabolita nelle fasi stazionarie e mobili e fornisce la separazione dei metaboliti in un approccio complementare a quelli applicati nello spettrometro di massa. La previsione in silico dei tempi di ritenzione, per esempio basata sui valori log P per le applicazioni in fase inversa e HILIC, è in fase di sviluppo nella comunità di ricerca. Ulteriori ricerche e sviluppi sono necessari per migliorare la previsione dei tempi di ritenzione in silico e per introdurre indici di ritenzione per consentire il confronto dei dati tra diversi strumenti e colonne. Questo spettro di massa definisce l’m/z di tutti gli ioni presenti in quel momento. Per le fasi stazionarie HILIC applicate all’analisi di tutti i tipi di campioni e le fasi stazionarie C18 per l’analisi delle urine, viene abitualmente applicato un intervallo m/z da 50 (o 100) a 1000. Per gli studi lipidomici si applica un intervallo m/z di 200-1500 o 2000, il limite superiore più alto permette di rilevare triacilgliceridi e cardiolipine di peso molecolare superiore. Ogni scansione completa produce uno spettro di massa con dati di m/z e intensità, che possono essere utilizzati per tracciare cromatogrammi a ione singolo o cromatogrammi a picco base con elevata precisione di massa per ogni metabolita rilevato. I cromatogrammi a ione singolo tracciano una singola m/z con un intervallo di massa definito dall’utente per ogni punto di dati acquisito in un cromatogramma, mentre i cromatogrammi a picco base tracciano la m/z di intensità più elevata per ogni punto di dati, la m/z tracciata può essere la stessa o possono essere tracciati dati m/z diversi per punti di dati diversi. I cromatogrammi a ioni singoli vengono tracciati per definire le aree di picco, che vengono applicate nell’analisi dei dati nel software di elaborazione dati. La complessità dello spettro di massa a ionizzazione elettrospray in cui vengono rilevate più caratteristiche del metabolita che rappresentano lo stesso metabolita sarà discussa nella sezione 8.
La frammentazione in fase gassosa dei metaboliti viene applicata per generare uno spettro di massa MS/MS, che è rappresentativo della struttura chimica del metabolita, poiché strutture chimiche diverse genereranno diversi spettri MS/MS. Lo spettro MS/MS dipende dalla struttura chimica e può essere applicato (idealmente in combinazione con la separazione cromatografica) per identificare diversi isomeri, che hanno lo stesso m/z. Possono essere acquisiti due diversi tipi di dati MS/MS: analisi dipendente dai dati (DDA) e analisi indipendente dai dati (DIA/SWATH). DDA è l’approccio tradizionale da applicare, che acquisisce uno spettro di massa prescan da cui un certo numero di picchi m/z sono scelti per essere isolati (tipicamente in un quadrupolo) analizzatore di massa seguito da frammentazione in una cella di collisione e successiva analisi di massa per acquisire lo spettro di massa dello ione prodotto MS/MS. La scelta di un singolo o più picchi m/z da isolare e frammentare in serie è tipicamente basata sull’intensità, con il m/z di più alta intensità che viene isolato e frammentato per primo. Questo è definito in alto approccio “n” dove n è il numero di diversi picchi m/z frammentati tra ogni acquisizione full-scan. Un certo numero di regole può essere applicato computazionalmente per garantire (1) la raccolta ripetitiva della stessa finestra di isolamento m/z non è osservato attraverso un conteggio ripetuto; (2) picchi di rumore chimico non sono frammentati attraverso l’uso di un elenco di esclusione predefinito; (3) metaboliti sono frammentati attraverso l’uso di un elenco di inclusione. Una larghezza di isolamento è definita dall’analista ed è tipicamente ± 1 o 2 Da e quindi un singolo o più metaboliti possono essere isolati e frammentati e uno spettro di massa MS/MS composito generato. Una larghezza di isolamento di > 1.0 Da permette ai picchi isotopici 13C (il 13C, un isotopo stabile, è presente a circa l’1,1% in abbondanza naturale) di essere inclusi nel processo di frammentazione e le informazioni isotopiche 13C di essere osservate nello spettro di massa MS/MS. La purezza della finestra di isolamento non è normalmente inclusa nella corrispondenza degli spettri MS/MS sperimentali con gli spettri MS/MS disponibili nelle librerie di spettro di massa e acquisiti attraverso l’analisi di standard chimici puri autentici. Software per calcolare la purezza di MS / MS spettri di massa (msPurity) è stato recentemente sviluppato e ha dimostrato che una purezza media del 70% o superiore è abitualmente osservato in studi di fenotipizzazione metabolica non mirati. Anche se DDA è il più applicato di routine, ha delle limitazioni (1) gli spettri di massa MS/MS per tutti i metaboliti non vengono acquisiti in analisi di 15 minuti; (2) diversi tipi di ioni (ad esempio, ioni addotti protonati e sodiati) dello stesso metabolita possono essere entrambi scelti per la frammentazione anche se solo un tipo di ione è richiesto; (3) il tipo di ione frammentato non è intelligentemente definito anche se diversi tipi di ioni possono frammentare più facilmente e in modo più informativo (ad esempio, uno ione protonato sarebbe più appropriato e informativo di uno ione addotto sodiato, che si frammenta attraverso la perdita dello ione sodio senza altre frammentazioni significative osservate). L’energia di collisione applicata per acquisire uno spettro MS/MS informativo dipende anche dalla struttura chimica, nessuna singola energia di collisione è appropriata per tutti i metaboliti e invece una vasta gamma di energie di collisione dovrebbe essere applicata. Diversi approcci possono essere applicati per massimizzare gli spettri MS/MS informativi acquisiti. Il primo approccio applica più energie di collisione per la frammentazione dello stesso metabolita seguita dalla combinazione di più spettri MS / MS in un unico spettro di massa composito MS / MS, e questo è definito come energie di collisione a gradini. Il secondo approccio applica la stessa energia di collisione per una singola iniezione del campione ma applica una diversa energia di collisione per diverse iniezioni del campione. Questo permette di energia di collisione-specifica MS / MS spettri da acquisire. Tuttavia, la limitazione principale di acquisizione dei dati DDA è che uno spettro di massa MS / MS non viene acquisito per tutti i metaboliti in studi non mirati.
Per superare la copertura ridotta di metaboliti con MS / MS dati acquisiti quando DDA viene applicato, un approccio alternativo chiamato analisi indipendente dai dati può essere applicato; questo è anche indicato come SWATH. Come il nome implica, l’acquisizione dei dati MS/MS è indipendente dai dati e da qualsiasi regola applicata in DDA. Invece, vengono applicate finestre di isolamento più ampie (ad esempio, 25 Da) e uno spettro di massa MS/MS viene acquisito per tutti gli ioni presenti in ogni finestra di isolamento in serie attraverso l’intero intervallo m/z. Questo approccio assicura che uno spettro di massa MS / MS viene acquisito per tutti i metaboliti anche se lo spettro di massa MS / MS può essere un composto di più metaboliti o ioni di rumore chimico e quindi una minore purezza MS / MS spettro è costruito. La risoluzione dei picchi cromatografici che non sono coeluenti può essere applicata per derivare computazionalmente lo spettro di massa MS/MS per ogni metabolita separato. Lo spettro di massa può essere applicato per l’annotazione del metabolita o per la quantificazione perché MS / MS dati sono continuamente raccolti per tutti i metaboliti. Per consentire l’acquisizione dei dati DIA, sono necessari spettrometri di massa con velocità di scansione veloce o UPLC con picchi cromatografici più ampi per garantire che un numero adeguato di punti di dati di scansione completa sono raccolti attraverso un picco cromatografico in combinazione con fino a 40 finestre DIA anche essere acquisiti. I metodi DIA sono nati dallo sviluppo delle tecnologie SWATH da parte di Aebersold e successivamente commercializzate da Sciex, prima per applicazioni proteomiche e più recentemente per applicazioni metabolomiche. Anche altre piattaforme strumentali forniscono capacità DIA. Nella proteomica, una libreria DIA composta dallo spettro di massa MS/MS per tutte le possibili proteine/peptidi è tipicamente applicata per assistere e aumentare la precisione della fase di deconvoluzione cercando ogni spettro di massa. Questo può essere eseguito come il proteoma completo è noto e la costruzione in silico di librerie MS/MS è stata eseguita. Tuttavia, per la fenotipizzazione metabolica, tutti i metaboliti che dovrebbero essere presenti non sono attualmente noti, la mancanza di standard chimici autentici è limitante e in silico approcci per la previsione accurata di MS/MS spettri di massa sono attualmente limitati. Pertanto, questo approccio può essere applicato per un sottoinsieme di metaboliti noti con una libreria MS/MS o un approccio DIA non mirato può essere applicato con deconvoluzione essere eseguita dipendente o indipendente da una libreria MS/MS (ad esempio, applicando MS-DIAL ).
Alcuni metodi applicano un intervallo m/z per la finestra di isolamento identico alla gamma m/z scansione completa che porta a tutti gli ioni in questa finestra di isolamento grande essere frammentato e produzione di un complesso spettro di massa MS/MS che richiedono deconvoluzione computazionale. Le piattaforme Waters possono applicare l’MSE in cui una bassa e un’alta energia di collisione sono applicate alternativamente per raccogliere dati full-scan e dati MS/MS per tutti gli ioni ad ogni punto temporale e le piattaforme Thermo Scientific possono applicare la All Ion Fragmentation (AIF). La risoluzione cromatografica dei metaboliti e la velocità di scansione possono avere un impatto significativo sull’accuratezza della fase di deconvoluzione e sulla purezza degli spettri di massa MS/MS dei singoli metaboliti.