Pendant son service dans l’armée, il devient tireur d’élite. Le capitaine convainc Fleming de faire carrière dans la recherche plutôt que dans la chirurgie, afin qu’il puisse rester à l’école. Fleming est pris sous l’aile de Sir Almroth Wright, un pionnier de l’immunologie et de la recherche sur les vaccins. Fleming est resté dans ce groupe de recherche pendant toute sa carrière.
En tant que capitaine du corps médical de l’armée pendant la Première Guerre mondiale, il a vu beaucoup de ses compagnons d’armes mourir à cause d’une infection non contrôlée. À l’époque, les antiseptiques étaient utilisés et causaient souvent plus de mal que de bien. Fleming a écrit un article sur les bactéries anaérobies présentes dans les plaies profondes, qui n’étaient pas détruites par les antiseptiques. Ses recherches n’ont pas été acceptées au départ, mais il a continué.
En 1922, Fleming a découvert le lysozyme, une enzyme aux faibles propriétés antibactériennes qui inhibait la croissance bactérienne. Il a également trouvé du lysozyme dans les ongles, les cheveux, la salive, la peau et les larmes. Au cours de ses recherches, Fleming a constaté que le lysozyme n’était efficace que contre un petit nombre de bactéries non nuisibles.
En 1928, il a commencé à faire des recherches sur les bactéries staphylococciques communes. Une boîte de Pétri découverte près d’une fenêtre ouverte a été contaminée par des moisissures. Fleming s’est rendu compte que les bactéries proches de la moisissure étaient en train de mourir. Il a isolé la moisissure et l’a identifiée comme étant du genre Penicillium, qu’il a trouvé efficace contre tous les agents pathogènes à Gram positif. Les agents pathogènes à Gram positif provoquent des maladies telles que la diphtérie, la gonorrhée, la méningite, la pneumonie et la scarlatine. Fleming a découvert que ce n’était pas la moisissure elle-même mais un « jus » qu’elle avait produit qui avait détruit les bactéries. Il a nommé ce « jus de moisissure » pénicilline.
Plus tard, Fleming a déclaré : « Lorsque je me suis réveillé juste après l’aube le 28 septembre 1928, je n’avais certainement pas prévu de révolutionner toute la médecine en découvrant le premier antibiotique, ou tueur de bactéries, du monde. Mais je suppose que c’est exactement ce que j’ai fait. »
Au départ, la communauté médicale n’était pas si enthousiaste à l’égard de la découverte de Fleming sur la pénicilline. Il avait également du mal à isoler de grandes quantités de « jus de moule ». En 1940, alors que Fleming était sur le point de prendre sa retraite, 2 collègues scientifiques, Ernst Chain et Howard Florey, se sont intéressés à la pénicilline. Rapidement, ils ont pu produire en masse de la pénicilline pour l’utiliser pendant la Seconde Guerre mondiale.
Fleming a reçu de nombreuses récompenses, dont 30 diplômes honorifiques, et surtout le prix Nobel de physiologie/médecine en 1945. Il a également été nommé l’une des personnes les plus importantes du 20e siècle par le Time Magazine.
En ce qui concerne sa vie personnelle, Fleming était connu pour être modeste, patient, calme, timide et sans émotion. Il évitait l’attention et était même parfois douloureusement silencieux en présence d’amis proches et même de sa femme, Sarah Marion McElroy, une infirmière. Fleming et sa femme ont eu un fils, Robert, qui est devenu médecin généraliste. Lorsqu’elle décède après 34 ans de mariage, Fleming vit une période très difficile. Il se perd dans son travail, passant la plupart de son temps derrière les portes closes du laboratoire. En 1953, Fleming épousa le docteur Amalia Koutsouri-Vourekas dans une église grecque de Londres.
Il mourut chez lui, d’une thrombose coronarienne, en 1955, après avoir souffert de maux d’estomac pendant des semaines.
On a dit que Fleming « est mort comme il le souhaitait : tranquillement, sans déclin progressif de ses capacités physiques ou mentales, et même sans incommoder son médecin. »
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