Est-ce qu’il existe des bactéries pléomorphes naturellement présentes dans le sang d’humains sains ?

Dans notre recherche de spirochètes impliqués dans la maladie d’Alzheimer (13), nous avons observé des bactéries pléomorphes dans le sang de sujets humains sains par microscopie à fond noir. Cette découverte a été surprenante car il est généralement admis que la circulation sanguine chez l’homme sain est un environnement stérile (7), sauf en cas de rupture de l’intégrité des membranes tissulaires (6). Cependant, le concept de la présence de bactéries dans le sang d’humains sains est maintenant plus plausible en raison des approches de laboratoire indépendantes de la culture. Les principales techniques utilisées dans ces études sont l’amplification par PCR et le séquençage de l’ADN ribosomal (ADNr) 16S. Ces méthodes ont révélé la présence d’une grande diversité de micro-organismes dans l’environnement, et même dans le corps humain (12). Dans ce rapport, nous présentons des preuves basées sur des techniques de phylogénie moléculaire et sur la microscopie optique et électronique, ainsi que sur d’autres méthodes microbiologiques conventionnelles, de l’existence d’une population de bactéries dans le sang humain sain. Compte tenu de la nature apparemment controversée de nos résultats, il est encourageant de noter le rapport récent de Nikkari et al. (14), qui ont détecté des séquences d’ADNr bactériennes associées au sang en utilisant des méthodes de PCR en temps réel et une sonde ciblant des régions conservées de l’ADNr 16S bactérien, et un rapport antérieur de Tedeshi et al. (16) sur la présence de bactéries pléomorphes en tant que parasites intraérythrocytaires chez des sujets humains cliniquement sains.

Pour l’examen au microscope léger, des échantillons de sang provenant de 25 volontaires sains ont été prélevés dans un tube Vacutainer sans anticoagulant (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.) ; le sang a été prélevé selon la méthode classique impliquant une antisepsie de la peau et l’évitement de toute introduction de micro-organismes externes par contamination. (La contamination externe étant toujours possible, une attention et des précautions particulières ont été prises à tout moment pour l’éviter. Les procédures spécifiques, ainsi que les contrôles appropriés, sont précisés tout au long du texte). Un montage humide du sérum du sang coagulé de chaque échantillon, frais ou incubé à 30°C pendant 5 à 7 jours, a été examiné par microscopie à fond noir (Leitz Dialux 20) à la recherche de bactéries pléomorphes.

Pour l’amplification par PCR, une aliquote de 0,5 ml de sang incubé contenant des bactéries pléomorphes a été utilisée pour l’extraction conventionnelle de l’ADN selon la méthode de Higuchi (11). Trois microlitres de l’extrait ont été utilisés pour l’amplification de l’ADN par la méthode d’Edwards et al. (8) en utilisant l’amorce directe BSF8/20 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) et l’amorce inverse BSR1541/20 (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′).Trente cycles de PCR ont été effectués, un cycle étant constitué des étapes suivantes : (i) dénaturation (1 min à 94°C), (ii) recuit (30 s à 70°C), et (iii) extension (90 s à 72°C). L’ADN polymérase Vent (New England BioLabs, Mississauga, Ontario, Canada) a été utilisée en raison de sa capacité de relecture.

Les amplicons ont été résolus par électrophorèse sur gel standard et détectés par coloration au bromure d’éthidium. L’ADN a été purifié à l’aide du kit Geneclean II (Bio 101, Inc., La Jolla, Calif.), et l’ADN a été cloné dans le site SmaI du vecteur pBluescript II (Stratagene, La Jolla, Calif.). L’analyse des séquences nucléotidiques de deux clones prélevés au hasard a été réalisée à l’aide du séquenceur automatique d’ADN ABI (modèle 373A) et des kits de séquençage par cycle ABI Prism avec la polymérase AmpliTaq FS (Perkin-Elmer Corp., Boston, Mass.).

Le gène gyrB a été amplifié par PCR selon le protocole décrit par Yamamoto et Harayama (21). Les amplicons ont été clonés à l’aide du kit de clonage TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).

Les données de séquence ont été analysées à l’aide du programme BLASTN du National Center for Biotechnology Information (Bethesda, Md.) (1). Les séquences candidates ayant les scores les plus élevés ont été récupérées en conséquence et alignées à l’aide du programme NALIGN de PC/Gene (Intelligenetics, Inc.).

Pour réaliser l’hybridation fluorescente in situ (FISH), du sang a été prélevé dans les conditions d’asepsie identiques habituelles (pour éviter toute contamination) sur trois sujets sains et incubé pendant 6 jours à 30°C dans des tubes en verre intérieurs stériles de marque Vacutainer (16 par 100 mm). L’échantillon de sang a été dilué au 1:10 avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) complétée par du pyrophosphate 10 mM. L’échantillon a été centrifugé pendant 5 s, puis filtré à travers un filtre à seringue Acrodisc stérile de 0,8μm de porosité pour éliminer les globules rouges et les débris. Des aliquotes d’un millilitre de l’échantillon ont été centrifugées pendant 10 min à 14 000 × g. Les procédures de fixation et d’hybridation ultérieures ont été effectuées selon le protocole décrit par Thomas et al. (17). En bref, les cellules bactériennes granulées ont été fixées avec 1 ml de paraformaldéhyde à 3% (pt/vol) fraîchement préparé à 4°C pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été granulées pendant 10 min à 14 000 × g et perméabilisées en incubant le culot avec 1 ml d’un mélange froid d’éthanol et de PBS (1:1, vol/vol) pendant 5 min à 25°C. Les bactéries ont été lavées avec du PBS pendant 5 min à 25°C. Les bactéries ont été lavées avec du PBS et remises en suspension dans 50 μl de tampon d’hybridation (0,9 M NaCl, 20 mM Tris ) préchauffé à 50°C et complété avec 10 ng de sondes fluorescentes par μl. Les sondes utilisées étaient toutes des oligonucléotides marqués à la fluorescéine ciblant l’ARNr : la sonde eubactérienne (EUB) BSR1541/20 (8) ; non-EUB, qui est complémentaire de la sonde bactérienne universelle EUB utilisée comme contrôle négatif de la non-spécificité (3) ; et la sonde eucaryote EUK (18). Les suspensions ont été incubées pendant 24 h à 50°C, et l’hybridation a été arrêtée en centrifugeant les échantillons pendant 2 min à 8 000 × g, en jetant le surnageant et en ajoutant 1 ml de PBS. Du bromure d’éthidium (0,5 μg/ml) a été ajouté juste avant l’analyse par cytométrie en flux.

Pour la microscopie électronique, les cellules bactériennes dans les échantillons de sang incubés de sujets sains ont été séparées des éléments sanguins par la méthode suivante. Une dilution 1:10 de sang dans du PBS a été centrifugée dans une microcentrifugeuse à 14 000 × g pendant 5 s. Le surnageant a été retiré et centrifugé comme décrit ci-dessus pendant 10 min. Il a été décanté, et le culot a été lavé deux fois dans du PBS. Le culot contenant une forte concentration de bactéries du sang a été remis en suspension dans un dernier petit volume de PBS. Alternativement, le sang dilué à 1:10 dans du PBS a été filtré à travers un filtre à membrane de 0,45-μm de porosité. Le filtrat a été centrifugé à 14 000 × g pendant 10 min, et le culot a été lavé deux fois avec du PBS. Ce culot a également été remis en suspension dans un petit volume de PBS pour la microscopie électronique. Une coloration négative a été effectuée avec de l’acide phosphotungstique à 2 %. Pour préparer les coupes ultrafines, les cellules ont été fixées dans du glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon cacodylate 0,1 M pendant 2 h. Les cellules ont ensuite été déshydratées, incluses et coupées. Les sections ont été colorées avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb et examinées à l’aide du microscope électronique à transmission (MET) JEOL 2000 FX.

Prompts par notre observation de ce qui semblait être un microbe inhabituel dans un échantillon de sang provenant d’un individu sain, nous avons criblé plusieurs échantillons de sang pour la présence de bactéries par amplification PCR de l’ADNr 16S en utilisant des amorces universelles. Aucun produit provenant du sang du jour 0 n’a été détecté (par coloration au bromure d’éthidium), mais le produit PCR était détectable après que le sang ait été incubé à 30°C pendant 5 jours. L’inoculation d’aliquotes d’échantillons de sang du jour 0 ou du jour 5 dans un bouillon nutritif n’a entraîné aucune croissance des bactéries. De toute évidence, le signal PCR obtenu ne résultait pas d’une contamination bactérienne saprophyte.

Les fragments d’ADN amplifiés par PCR, d’une taille de 1,2 et 1,5 kb, issus de ces bactéries ont été clonés. Deux plasmides recombinants, B16 et T5, ont été utilisés pour le séquençage de l’ADN. Les deux séquences étaient identiques à l’exception d’une extrémité 5′ tronquée dans B16. Le gène de l’ARNr 16S presque complet de T5 (1 257 pb) présentait une identité de 99,6 % avec la séquence de 1 500 pb de Stenotrophomonas maltophilia LMG958T, une souche type de la collection de cultures du Laboratorium voor Microbiologie Gent, Gand, Belgique. La séquence de T5 déterminée sur les deux brins a montré quatre transitions et deux transversions par rapport à la séquence de LM958T (numéro d’accession GenBank X95923). Ce résultat a été confirmé avec un deuxième échantillon provenant d’un autre sujet. (La position phylogénétique de S. maltophilia a fait l’objet de recherches intensives. Appelé à l’origine Pseudomonas maltophilia, il a ensuite été appelé Xanthomonas maltophilia. S. maltophilia est regroupé dans la sous-classe gamma des protéobactéries et représente un taxon distinct.)

L’amplification indépendante de l’ADNr 16S à partir d’échantillons de sang de trois autres sujets a été réalisée par l’un d’entre nous (M. Sirois) à l’Université du Québec à Trois-Rivières au Canada. L’analyse de la séquence du gène ribosomal 16S des échantillons sanguins de ces trois sujets a montré que le genre bactérien présentant l’homologie la plus proche était Pseudomonas. Cela corrobore nos résultats à l’Université McGill, puisque Stenotrophomonas, comme indiqué ci-dessus, faisait auparavant partie du genre Pseudomonas.

En plus des résultats de l’ARNr 16S obtenus à l’Université McGill, nous avons également amplifié par PCR le gène gyrB des bactéries provenant des échantillons de sang. Le gène gyrB code pour la protéine de la sous-unité B de l’ADN gyrase. L’amplification par PCR du gène gyrB est une nouvelle méthode moléculaire pour détecter et identifier les souches bactériennes (21). La séquence du fragment PCR de 475 pb, que nous avons obtenu dans notre laboratoire, s’est avérée différente de celle du gène gyrB partiel (1 252 pb) de la souche type ATCC 13637 de S. maltophilia. Ainsi, l’isolat que nous avons isolé du sang n’est pas identique à S. maltophilia ATCC 13637, mais est plutôt une autre souche.

La FISH des bactéries du sang a également été réalisée (2, 4). Nous avons constaté que les méthodes conventionnelles de FISH sur cellules entières utilisant la sonde oligonucléotidique BSR1541/20 marquée à la fluorescéine (complémentaire d’une région à l’extrémité 3′ de l’ARNr 16S conservée pour toutes les eubactéries) étaient inadaptées en raison de la lyse des bactéries fragiles. Pour contourner ce problème, la suspension bactérienne sanguine a été étudiée par un protocole FISH et la cytométrie en flux laser (LFC) (3, 17). Cette technique a le potentiel d’analyser rapidement les bactéries viables mais non cultivables.

La figure 1A montre le profil de diffusion de la lumière de la suspension bactérienne enregistrée par LFC qui reflète les cellules et les éventuels débris et bruit de fond. Nous avons marqué une région (région a) de ce profil dans laquelle des événements fluorescents ont été enregistrés. Les signaux fluorescents émis par les cellules qui se sont hybridées avec la sonde non spécifique (non EUB) marquée à la fluorescéine (intensité fluorescente moyenne de 3,9) sont représentés sur la figure 1B. Les IFM enregistrées dans la région e sur des échantillons de sang prélevés chez trois individus différents à deux jours différents étaient 2,5 à 3,7 fois plus élevées avec la sonde BSR1541/20 que celles obtenues avec la sonde non-EUB (tableau 1). Les signaux fluorescents de la sonde EUK marquée à la fluorescéine (17), spécifique d’une région de l’ARNr 18S conservée chez tous les eucaryotes, n’étaient pas différents de ceux de la sonde non-EUB.

Pour caractériser davantage ce groupe de bactéries, des études morphologiques ont été réalisées. Les échantillons de sérum prélevés de manière aseptique sur 25 volontaires, puis laissés coaguler, ont révélé la présence de bactéries examinées par microscopie à fond noir. La figure 2 montre la morphologie d’un groupe de cellules préparées à partir d’un échantillon de sérum.

En plus de leurs mouvements cellulaires, tels que la flexion, la nature viable de ces bactéries pléomorphes a été renforcée par leur capacité à augmenter en nombre modeste dans le sérum lors de l’incubation aérobie d’un échantillon de sang coagulé à 30°C pendant 7 jours. Le tableau 2 montre l’augmentation du nombre de cellules dans sept échantillons de sang. Les organismes n’étaient pas des contaminants bactériens saprophytes, car aucune croissance bactérienne n’a été observée lorsque des aliquotes de sérum ont été ensemencés sur un milieu gélosé enrichi. Malheureusement, les tentatives de culture des bactéries sur divers milieux de laboratoire enrichis, tels que la gélose nutritive pour le sang, la gélose pour spirochètes, la gélose pour mycoplasmes et le milieu pour leptospires, ont échoué. On en a conclu que les bactéries pléomorphes présentes dans le sang étaient viables mais ne pouvaient être cultivées in vitro par les techniques conventionnelles. Il convient de noter que les lavages des tubes de prélèvement sanguin n’ont donné aucune bactérie pléomorphe lorsqu’ils ont été examinés au microscope à fond noir, ce qui indique que les tubes n’étaient pas les sources de ces bactéries.

Les bactéries isolées des échantillons de sang ont été sélectivement inhibées par les antibiotiques. Le tableau 3 montre les effets de deux antibiotiques sur la croissance des bactéries dans les sérums. La polymyxine B était la plus inhibitrice, tandis que la bacitracine avait des effets limités.

Une micrographie d’une section fine de bactéries isolées d’échantillons de sang est présentée à la figure 3. Les cellules étaient entourées d’une double membrane sans aucun signe d’une couche dense de peptidoglycane ; aucun noyau discret ou organite intracellulaire lié à la membrane typique des eucaryotes n’a été trouvé. Il est évident que les bactéries pléomorphes du sang sont des entités hautement organisées plutôt que des débris protéiques aléatoires résultant de la dégradation des éléments cellulaires du sang.

Par l’utilisation de techniques de PCR et de FISH, nous avons pu démontrer que le sang de sujets humains cliniquement sains contient de l’ADN bactérien. La PCR du gène de l’ARNr 16S a été largement utilisée pour identifier les bactéries non cultivables dans l’environnement (5, 9) ; une telle identification a également été réalisée avec des bactéries inconnues au sein de l’hôte humain (12) et récemment dans le sang de sujets humains cliniquement sains (14). La FISH a été utilisée avec succès pour la détection de micro-organismes uniques intacts spécifiques au sein d’échantillons environnementaux, tels que l’eau d’un lac (18), le sol (17) et les boues activées (20), et de bactéries anaérobies non cultivées dans la flore fécale humaine (19).

Notre rapport de bactéries pléomorphes viables naturelles dans le sang d’humains sains ne devrait pas être controversé. G. Tedeshi et al. de l’Université de Camerino en Italie avaient signalé la présence de bactéries similaires en tant que parasites intraérythrocytaires de sujets humains cliniquement sains en 1969 dans la revue Nature (16). Ils ont montré que les globules rouges augmentaient l’absorption ou l’incorporation de thymine, d’uridine et de glycine radioactives en raison de la présence de ces bactéries. L’incorporation de ces composés ne fait pas partie de l’activité métabolique normale des érythrocytes. La découverte récente de l’ADNr 16S bactérien dans le sang de sujets humains sains par Nikkari et al. (14) ajoute de la crédibilité à nos résultats. En utilisant des techniques contemporaines de biologie moléculaire, nous avons démontré la présence de bactéries discrètes dans le sérum de sujets humains sains qui partagent une similarité morphologique avec celles documentées par Tedeshi et al. (16). Nos conclusions sont qu’il existe des bactéries pléomorphes dans le sang d’humains sains.

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