4 types de données acquises dans les études UPLC-MS
Les plateformes UPLC-MS acquièrent trois différents types de données par acquisition en ligne dans les applications de routine (1) temps de rétention chromatographique ; (2) spectres de masse m/z précis à balayage complet ; et (3) spectres MS/MS. Les données de mobilité ionique peuvent également être acquises en ligne. Ces quatre types de données peuvent être appliqués pour identifier les structures chimiques de métabolites dont l’identité n’était pas connue avant l’acquisition des données ou pour confirmer l’identité de métabolites dont l’identité était connue avant l’acquisition des données. La collecte de données MSn où n > 2 n’est pas systématiquement acquise en ligne et, au lieu de cela, la collecte et la perfusion de fractions pendant des minutes sont appliquées, par exemple en utilisant un système Triversa Nanomate, qui permet de longues périodes de perfusion en utilisant de faibles volumes d’échantillons (< 10 μL) .
Le système UPLC et le spectromètre de masse génèrent des informations complémentaires. Le temps de rétention chromatographique est défini par la » solubilité » du métabolite dans les phases stationnaire et mobile et permet la séparation des métabolites selon une approche complémentaire à celles appliquées dans le spectromètre de masse. La prédiction in silico des temps de rétention, par exemple sur la base des valeurs log P pour les applications en phase inversée et HILIC, est en cours de développement au sein de la communauté des chercheurs. D’autres recherches et développements sont nécessaires pour améliorer la prédiction in silico des temps de rétention et pour introduire des indices de rétention afin de permettre la comparaison des données entre différents instruments et colonnes .
Au cours d’un passage chromatographique, un spectre de masse à balayage complet est collecté une ou plusieurs fois par seconde. Ce spectre de masse définit le m/z de tous les ions présents à ce moment-là. Pour les phases stationnaires HILIC appliquées à l’analyse de tous les types d’échantillons et les phases stationnaires C18 pour l’analyse de l’urine, une plage m/z de 50 (ou 100) à 1000 est couramment appliquée. Pour les études lipidomiques, une plage m/z de 200 à 1500 ou 2000 est appliquée, la limite supérieure plus élevée permettant la détection des triacylglycérides et des cardiolipines de poids moléculaire plus élevé. Chaque balayage complet produit un spectre de masse avec des données de m/z et d’intensité, qui peuvent être utilisées pour tracer des chromatogrammes à ion unique ou des chromatogrammes à pic de base avec une grande précision de masse pour chaque métabolite détecté. Les chromatogrammes à un seul ion représentent un seul m/z avec une plage de masse définie par l’utilisateur pour chaque point de données acquis sur un chromatogramme, tandis que les chromatogrammes à pic de base représentent le m/z de la plus haute intensité pour chaque point de données, le m/z représenté peut être le même ou des données m/z différentes peuvent être représentées pour différents points de données. Les chromatogrammes à un seul ion sont tracés pour définir les aires de pic, qui sont appliquées dans l’analyse des données dans un logiciel de traitement des données. La complexité du spectre de masse de l’ionisation par électronébulisation, où plusieurs caractéristiques de métabolites sont détectées et représentent le même métabolite, sera abordée dans la section 8.
La fragmentation en phase gazeuse des métabolites est appliquée pour générer un spectre de masse MS/MS, qui est représentatif de la structure chimique du métabolite, car différentes structures chimiques génèrent différents spectres MS/MS. Le spectre MS/MS dépend de la structure chimique et peut être appliqué (idéalement en combinaison avec une séparation chromatographique) pour identifier différents isomères, qui ont le même m/z. Deux types différents de données MS/MS peuvent être acquis, l’analyse dépendante des données (DDA) et l’analyse indépendante des données (DIA/SWATH). La DDA est l’approche traditionnelle à appliquer, qui acquiert un spectre de masse de préanalyse à partir duquel un certain nombre de pics m/z sont choisis pour être isolés (typiquement dans un analyseur de masse quadripolaire), suivi d’une fragmentation dans une cellule de collision et d’une analyse de masse ultérieure pour acquérir le spectre de masse de l’ion produit MS/MS. Le choix d’un seul ou de plusieurs pics m/z à isoler et à fragmenter en série est typiquement basé sur l’intensité, le m/z de plus forte intensité étant isolé et fragmenté en premier. Ceci est défini au sommet de l’approche « n » où n est le nombre de pics m/z différents fragmentés entre chaque acquisition full-scan. Un certain nombre de règles peuvent être appliquées par calcul pour garantir que (1) la collecte répétitive de la même fenêtre d’isolement m/z n’est pas observée par un comptage répété ; (2) les pics de bruit chimique ne sont pas fragmentés par l’utilisation d’une liste d’exclusion prédéfinie ; (3) les métabolites sont fragmentés par l’utilisation d’une liste d’inclusion. Une largeur d’isolement est définie par l’analyste et est généralement de ± 1 ou 2 Da et donc un seul ou plusieurs métabolites peuvent être isolés et fragmentés et un spectre de masse MS/MS composite généré. Une largeur d’isolement de > 1,0 Da permet aux pics isotopiques de 13C (le 13C, un isotope stable, est présent à environ 1,1 % à l’abondance naturelle) d’être inclus dans le processus de fragmentation et aux informations isotopiques de 13C d’être observées dans le spectre de masse MS/MS. La pureté de la fenêtre d’isolement n’est normalement pas prise en compte dans la comparaison des spectres MS/MS expérimentaux avec les spectres MS/MS disponibles dans les bibliothèques de spectres de masse et acquis par l’analyse d’étalons chimiques authentiques purs. Un logiciel permettant de calculer la pureté des spectres de masse MS/MS (msPurity) a récemment été mis au point et a montré qu’une pureté moyenne de 70 % ou plus est couramment observée dans les études de phénotypage métabolique non ciblées. Bien que la méthode DDA soit la plus couramment appliquée, elle présente des limites : (1) les spectres de masse MS/MS de tous les métabolites ne sont pas acquis dans les analyses d’une durée de 15 minutes ; (2) différents types d’ions (par exemple, les ions d’adduits protonés et sodés) du même métabolite peuvent tous deux être choisis pour la fragmentation, même si un seul type d’ion est requis ; (3) le type d’ion fragmenté n’est pas défini de manière intelligente, bien que différents types d’ions puissent se fragmenter plus facilement et de manière plus informative (par exemple, un ion protoné serait plus facile à fragmenter qu’un ion sodé), un ion protoné serait plus approprié et plus informatif qu’un ion d’adduit sodié, qui se fragmente par la perte de l’ion sodium sans qu’aucune autre fragmentation significative ne soit observée). L’énergie de collision appliquée pour acquérir un spectre MS/MS informatif dépend également de la structure chimique, aucune énergie de collision unique n’est appropriée pour tous les métabolites et une large gamme d’énergies de collision doit être appliquée. Différentes approches peuvent être appliquées pour maximiser les spectres MS/MS informatifs acquis. La première approche consiste à appliquer plusieurs énergies de collision pour fragmenter le même métabolite, puis à combiner plusieurs spectres MS/MS en un seul spectre de masse MS/MS composite, ce qui est défini comme des énergies de collision échelonnées. La deuxième approche consiste à appliquer la même énergie de collision pour une seule injection d’échantillon, mais à appliquer une énergie de collision différente pour différentes injections d’échantillon. Cela permet d’acquérir des spectres MS/MS spécifiques à l’énergie de collision. Cependant, la principale limite de l’acquisition de données DDA est qu’un spectre de masse MS/MS n’est pas acquis pour tous les métabolites dans les études non ciblées .
Pour surmonter la couverture réduite des métabolites avec les données MS/MS acquises lorsque la DDA est appliquée, une approche alternative appelée analyse indépendante des données peut être appliquée ; elle est également appelée SWATH . Comme son nom l’indique, l’acquisition des données MS/MS est indépendante des données et de toute règle appliquée dans la DDA. Au lieu de cela, des fenêtres d’isolation plus larges sont appliquées (par exemple, 25 Da) et un spectre de masse MS/MS est acquis pour tous les ions présents dans chaque fenêtre d’isolation en série sur toute la gamme m/z. Cette approche garantit l’acquisition d’un spectre de masse MS/MS pour tous les métabolites, bien que le spectre de masse MS/MS puisse être un composite de plusieurs métabolites ou d’ions de bruit chimique et que, par conséquent, un spectre MS/MS de moindre pureté soit construit. La résolution des pics chromatographiques qui ne sont pas coelutifs peut être appliquée pour dériver par calcul le spectre de masse MS/MS pour chaque métabolite séparé. Le spectre de masse peut être utilisé pour l’annotation des métabolites ou pour la quantification car les données MS/MS sont collectées en continu pour tous les métabolites. Pour permettre l’acquisition de données DIA, des spectromètres de masse à vitesse de balayage rapide ou des UPLC à pics chromatographiques plus larges sont nécessaires pour garantir qu’un nombre approprié de points de données de balayage complet sont collectés sur un pic chromatographique, en combinaison avec jusqu’à 40 fenêtres DIA également acquises. Les méthodes DIA sont nées du développement des technologies SWATH par Aebersold, qui ont ensuite été commercialisées par Sciex, d’abord pour des applications protéomiques et plus récemment pour des applications métabolomiques. D’autres plateformes instrumentales offrent également des capacités de DIA. En protéomique, une bibliothèque DIA composée du spectre de masse MS/MS de toutes les protéines/peptides possibles est généralement appliquée pour aider et augmenter la précision de l’étape de déconvolution en recherchant chaque spectre de masse. Cette étape peut être réalisée lorsque le protéome complet est connu et que la construction in silico des bibliothèques MS/MS a été effectuée. Cependant, pour le phénotypage métabolique, tous les métabolites censés être présents ne sont actuellement pas connus, le manque de normes chimiques authentiques est limitant et les approches in silico pour la prédiction précise des spectres de masse MS/MS sont actuellement limitées. Par conséquent, cette approche peut être appliquée pour un sous-ensemble de métabolites connus avec une bibliothèque MS/MS ou une approche DIA non ciblée peut être appliquée avec une déconvolution effectuée de manière dépendante ou indépendante d’une bibliothèque MS/MS (par exemple, en appliquant MS-DIAL ).
Certaines méthodes appliquent une plage m/z pour la fenêtre d’isolement identique à la plage m/z du balayage complet conduisant à la fragmentation de tous les ions dans cette grande fenêtre d’isolement et à la production d’un spectre de masse MS/MS complexe nécessitant une déconvolution computationnelle. Les plateformes Waters peuvent appliquer la MSE où une énergie de collision faible et élevée est alternativement appliquée pour collecter des données de balayage complet et des données MS/MS pour tous les ions à chaque point de temps et les plateformes Thermo Scientific peuvent appliquer la fragmentation de tous les ions (AIF). La résolution chromatographique des métabolites et la vitesse de balayage peuvent avoir un impact significatif sur la précision de l’étape de déconvolution et la pureté des spectres de masse MS/MS à métabolite unique.
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